大豆凝集素(Soybean Agglutinin，SBA)是指大 豆中能與N—乙?；籇—半乳糖胺/半乳糖胺/半 乳糖特異性結合的糖蛋白，分子量約120kDa，由純化四個略有不同的亞基構成四聚體，每個亞基分子量約 30kDa,在超速離心中隨7S蛋白一起沉降自上 世紀中葉SBA被首次發(fā)現(xiàn)并命名以來，由于其具有 特殊的生物學功能（與游離的N—乙?；籇~?半 乳糖胺/半乳糖或細胞膜糖蛋白上的N_乙酰基一 D—半乳糖胺/半乳糖結合），如今在抗營養(yǎng)作用、選 擇性分離骨髓干細胞、分離糖蛋白、靶向給藥、植物 分類學及人類血型鑒定等方面的研究越來越多。

 

獲得高純度的SBA是進行上述研究的前提。 提取和純化SBA的方法較多，最初采用鹽析、移動 界面電泳結合超速離心沉淀技術，但只能得到少量的SBAM，后來又發(fā)展了離子交換和磷酸鈣層析 法[3<，而應用上述SBA的特殊生物學功能進行親 和層析是近年來普遍采用的方法。其中最常用的親 和層析體系是N—乙?；籇_半乳糖胺一epoxy 一 Sepharose 6B[5’S]、半乳糖胺一CH — Sepharose 4B[6W和瓜爾膠但這三種方法沒有系統(tǒng)的研究， 本實驗旨在比較三種親和層析體系的差異，并確定 其中的最佳方法，以大量提取SBA，進而用于抗營 養(yǎng)研究。

 

1材料與方法1.1材料1.1.1試驗樣品三種親和層析凝膠(N —乙酰基一D—半乳糖胺一epoxy —Sepharose 6B、半乳糖 胺一CH—Sepharose 4B和瓜爾膠）均購自Sigma公 司；大豆（豐交7607)購于吉林省春雨種子有限公 司。

 

1.1.2 主要試劑 SBA標準品購自Sigma公 司;硫酸銨、半乳糖等均為國產(chǎn)分析純。

 

1.2.3主要儀器低溫高速離心機（Sigma公司）、85—2磁力攪拌機（江蘇金壇市金城國勝實驗 儀器廠）、UV—2102PCS紫外可見光分光光度計 (龍尼柯儀器有限公司）、恒溫水浴(哈爾濱市東聯(lián)電 子技術開發(fā)有限公司）、BS —160型自動收集器（上 海滬西分析儀器廠）、PHS—3C型酸度計(上海偉業(yè) 儀器廠)等。

 

1.2方法1.2.1SBA粗提液的制備 稱取生大豆100g， 粉碎過40 0標準篩，置于500mL低沸石油醚(餾程 3CTC?60‘C)內攪拌提取4h脫脂，晾干。用磷酸緩 沖液（PBS，0. 01mol/L，pH7. 6)4’C 下浸提過夜。 lOOOOr/m離心20min，棄沉淀。上清液中加入固體 硫酸銨至85%飽和度，4'C下攪拌2h,1000〇r/m離 心20min，棄上清。沉淀溶于PBS，并用PBS透析 過夜，離心除去少量雜質，上淸即為SBA粗提液。

 

1.2.2SBA的純化 N—乙酰基一D—半乳糖 胺一epoxy — Sepharose 6B、半乳糖胺一CH — Seph?arose 4B 和瓜爾膠均 PBS 平衡處理后，前兩種凝膠 分別裝入1. 5 X 15cm的層析柱中，后者裝人3 X 40cm的層析柱中。將SBA粗提液分批加人各柱， 用PBS洗去雜蛋白，反復幾次，直至使凝膠的親和 能力達到飽和（洗脫液中測不出SBA)。至流洗液OD2Mnm<0. 01?后。換用含 0. ImoVLD-半乳糖 (半乳糖胺一CH-Sepharose 4B和瓜爾膠）或〇。 15m〇l/LD-半乳糖(N-乙酰基一D—半乳糖胺一 epoxy—Sepharose 6B)的 PBS 洗脫，流速為 0. 5 mL/min(半乳糖胺一CH —Sepharose 4B和瓜爾膠） 或0. 8 mL/min(N—乙丑基一D—半乳糖胺一epoxy —Sepharose 6B)，分管收集并合并 OD2Mnm>0. 1 的洗脫峰各管，即為純化的SBA。

 

1.2.3SBA的含量測定以紫外吸收法測定SBA的含量。

 

1.2.4SBA的活性檢測以兔紅細胞凝集試驗檢測SBA的活性。按紅細胞的凝集強度，以+ + + + (強凝集）、+ +十、+ +、+和一(不凝集)表示，以 出現(xiàn)+ +的SBA最高稀釋倍數(shù)為凝集效價。

 

1.2.5SBA的純度鑒定用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)對所提取的SBA進行純度 分析。

 

2結果與分析圖1 N—乙丑基一D—半乳糖胺一epoxy — Sepha- rose 6B和半乳糖胺一CH—Sepharose 4B體系 純化大豆凝集素曲線Fig. 1 Elution curve of SBA purification with Gal- NAc—epoxy — Sepharose 6B and GalNH2 — CH~ Sepharose 4B system由圖1可見，半乳糖胺一CH —Sepharose 4B的 雜蛋白洗脫峰較N—乙?；籇—半乳糖胺一epoxy -Sepharose 6B略早，而且蜂值高。這是由于N-乙 ?；鵢D—半乳糖胺對SBA的親和力遠大于半乳糖王利民等：三種親和層析體系純化大豆凝集素的比較研究1期胺對SBA的親和力。瓜爾膠層析柱的體積大，與 SBA的親和力小，故兩個峰收集的管數(shù)都較多，雜蛋 白洗脫峰值高，而SBA洗脫峰值低(圖2、圖3)。

 

2.2SBA產(chǎn)率及親和飽和度根據(jù)純化后SBA的終濃度和收集的總體積，計 算出其產(chǎn)率，即每l〇〇g生大豆經(jīng)三種親和層析柱純 化后所得的SBA。親和飽和度即每次上樣后當層 53 析柱對SBA的結合達到最大時，每毫升凝膠所能結 合的SBA量。由表1可見，三種親和體系中，N— 乙?；籇—半乳糖胺一epoxy — Sepharose 6B的 產(chǎn)率最高，其次是瓜爾膠和半乳糖胺_CH—Sepha- r〇se4B，后二者差異不顯著。三者的親和飽和度差 異均較顯著。

 

—>—005 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 洗脫體積（試管數(shù)）Elution volume ( No. of tubes )

 

圖2瓜爾膠體系純化大豆凝集素雜蛋白洗脫曲線 Fig. 2 Non—aimed protein elution curve of SBA purification with Guar system5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 洗脫體積（試管數(shù)）Elution volume ( No. of tubes )

 

圖3瓜爾膠體系純化大豆凝集素目的蛋白洗脫曲線 Fig. 3 Aimed protein elution curve of SBA purifica?tion with Guar system表1三種親和層析體系的大豆凝集素產(chǎn)率和親和飽和度比較12. 2 士 1.47. 5 士 1.3 2.1 士 1.6147.0士 15110.0士 12128.0士 16大豆凝集素SBA產(chǎn)率（mg/lOOg生大豆）親和飽和度（mg/mL凝膠）

 

Production rateAbsorbing capacityN—乙丑基一D—半乳糖胺一epoxy—Sepharose 6B GalNAc-epoxy—Sepharose 6B 半乳糖胺 _CH—Sepharose 4B GalNH2 — CH—Sepharose 4B 瓜爾膠Guar項目ItemTable 1 Comparison of production rate and absorbing capacity of SBA among the three affinity systems表2三種親和層析體系純化的大豆凝集素血凝效價比較Table 2 Comparison of agglutinating red blood cell effect of SBA among the three affinity systemsas P 件rmSample1* 24SBA 稀釋倍數(shù) Dilution times of SBA 8 16 32 64 1282565121024SBA標準品Standard sample+++++++++++++ + ++ + ++ + ++ + ++ ++ ++十純化樣品1Purified sample1++十十++++十十+++ +十+ + ++ + ++ ++ ++ ++十純化樣品2Purified sample2+ + + + 十+ ++ + ++ + ++ + ++ + ++ ++ +++純化樣品3Purified sample3+ + + ++ + ++ + ++ + ++ + ++ ++ ++ +++注*1、2、3分別代表N—乙?；籇_半乳糖胺一epoxy—Sepharose 6B、半乳糖胺一CH—Sepharose 4B和瓜爾多糖凝膠純化的SBA. *為SBA的起始濃度（lmg/mL)aNote：l ,2,3means SBA made by GalNAc—epoxy—Sepharose 6B, GalNHg—CH —Sepharose 4B and Guar gel.

 

* Indicates the initial concentration of SBAClmg /mL).

 

2.3 SBA的純度由圖4可見，三種親和層析體系純化的SBA'與 標準SBA的電泳結果一致，分子量約為30KDa，而 且沒有任何雜蛋白帶，表明所純化的SBA純度較 高。此結果與LotanW的報道一致。

 

2.4SBA的生物活性由表2可見，本試驗中SBA的凝集效價均為 256。三種親和層析體系純化的SBA的效價與購買 的SBA標準樣品沒有顯著差異。

 

雖然三種純化體系都是親和層析，但固相載體 上所連的配基不同，因而對SBA的特異性親和力也 不同。N_乙?；籇—半乳糖胺和半乳糖胺兩種 配基分別以化學方法共價結合于作為固相“支架” epoxy—Sepharose 6B(環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠6B) 和CH — Sepharose 4B(羧基瓊臘糖凝膠4B)上，且 CH —Sepharose 4B 的結構較 epoxy—Sepharose 6B 疏松[1°]，因而等量的體凝膠積，epoxy — Sepharose 6B結合N—乙酰基一D—半乳糖胺的位點多于CH —Sepharose 4B結合半乳糖胺的位點。而且N—乙 ?；籇—半乳糖胺對SBA的親和力又是半乳糖 胺對SBA的親和力的30倍[11]，因此該體系的SBA 洗脫峰、產(chǎn)率和親和飽和度都髙于半乳糖胺一CH_ Sepharose 4B體系。由于兩種配基對SBA的特異 性親和力不同，所以這兩種體系所用半乳糖洗脫液 的濃度和流速也不同。

 

瓜爾膠是主要（約80%)由半乳糖和甘露糖聚 合而成的天然半乳多縮甘露聚糖，由原產(chǎn)于非洲的 一種豆科草本植物瓜爾豆種子的胚乳加工精制而成 的天然植物膠，為大分子天然親水膠體。本試驗顯1期示，天然瓜爾膠對SBA的特異性親和能力只有N_ 乙丑基一D — 半乳糖胺一epoxy—Sepharose 613的 約1/6、半乳糖胺一CH — Sepharose 4B的約1/3,說 明SBA對半乳糖的親和力遠不如半乳糖胺和N — 乙?；籇—半乳糖胺。

 

綜上所述，用親和層析法純化大豆凝集素的最 理想方法是N—乙丑基一D—半乳糖胺_epoxy— Sepharose 6B體系，但價格較貴。瓜爾膠成本較低， 但產(chǎn)率也低。