混濁蘋果汁中的懸浮顆粒被認(rèn)為是帶負(fù)電的、部分 脫甲氧基的果膠包裹著帶正電的蛋白質(zhì)核，這些小的雜 質(zhì)的顆粒是在果汁提取階段形成另外，混濁蘋果汁 中還有淀粉、蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物、原花青素氧化聚合 物等顆粒。這些微粒在果汁這種膠體體系中時(shí)時(shí)刻刻在 運(yùn)動(dòng)，不可避免地因相互碰撞增大其尺寸。另外，原先屬 于可溶性的物質(zhì)會(huì)因多種復(fù)雜因素而轉(zhuǎn)化成不溶的新 顆粒，直接和/或間接促成大的顆粒的形成。果汁的果 膠也會(huì)隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的升高而降解，結(jié)合 其他因素而使果汁的粘度降低，最終導(dǎo)致果汁變清、分 層等混池穩(wěn)定性喪失現(xiàn)象的發(fā)生。所以，混汁混濁穩(wěn)定 性的保持是困繞食品研究者的一大難題。

 

目前改善濁汁混濁穩(wěn)定性較為普遍的方法是添加 穩(wěn)定劑％通過增加果汁的粘度，和/或增加果汁中懸浮顆粒的某種電荷(多為負(fù)電荷)的帶電量以增加顆粒間 的斥力，來達(dá)到改善濁汁穩(wěn)定性的目的。例如，通蒸汽工 藝就是通過釋放更多的蘋果內(nèi)源果膠，增加果汁的粘度 來實(shí)現(xiàn)此目的[4>。GenoveseD等人P]曾考察了往混濁蘋 果汁中添加幾種食用膠的效果，發(fā)現(xiàn)羧甲基纖維素 (CMC)可改善果汁的混濁穩(wěn)定性。但他們只利用離心 后測(cè)定果汁濁度的方法來考察果汁的混濁穩(wěn)定性，沒研 究?jī)?chǔ)藏過程中果汁濁度的變化，也未分析果汁沉淀物的 成分。其他相關(guān)研究未見報(bào)道。

 

筆者在分析了果汁沉淀物成分和原因的基礎(chǔ)上，往 果汁中添加幾種有代表性的添加劑，并通過120d的儲(chǔ) 藏實(shí)驗(yàn)，來研究改善混濁蘋果汁混濁穩(wěn)定性的方法，并 進(jìn)一步探討濁汁的混濁穩(wěn)定機(jī)理。

 

1試驗(yàn)材料與發(fā)法 1.1主要儀器設(shè)備和材料GL-20B冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠； TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)，上海湘儀離心機(jī)儀器有限 公司；LGJ-10冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠； Agilentl 100高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司； 835-50氨基酸自動(dòng)分析儀，日本日立公司;BioRAD MiniPROTEAN 3Cell電泳儀，美國(guó);試驗(yàn)用均質(zhì)機(jī)，上 海張堰輕工機(jī)械廠。

 

5-羥甲基糠醛(5-HMF)、表兒茶素、根皮苷：Sigma 公司；電泳用標(biāo)準(zhǔn)蛋白：上海友思生物技術(shù)有限公司;羧 甲基纖維素(CMC):上海勵(lì)成食品工業(yè)有限公司;瓜爾 膠：美資上海凱惠(SK)食品添加劑有限公司;卡拉膠： Marcel公司;富士蘋果：購(gòu)自果品批發(fā)市場(chǎng)。

 

1.2混濁蘋果汁的制備和儲(chǔ)藏按文獻(xiàn)[5]制備混濁蘋果汁，并將同一批次的果汁和 對(duì)照(10.3° Brix)分別放置于4°C冰箱與22°C和40°C恒 溫培養(yǎng)箱中避光儲(chǔ)藏120d。

 

1.3果汁沉淀物的收集將12瓶在22°C|fc藏120d的果汁從瓶中小心吸出 (勿攪動(dòng)底部沉淀)，將底部的沉淀物和果汁集中收集。

 

將收集的沉淀物離心15min(700〇x g)。棄去離心 杯上部分液體，底部沉淀物用去離子水洗三遍后再冷凍 干燥。

 

取一部分收集的瓶中上部的果汁，加入固體硫酸 鉸，使終濃度達(dá)85%,靜置3 h,離心15min (700〇x g), 收集沉淀并透析30 h,再冷凍干燥。

 

1.4膠的添加和果汁的儲(chǔ)藏同1.2制汁。攪拌果汁，用2倍的蔗糖拌勻膠緩緩 加入果汁，膠的添加量為0.05%(W/V)。為使膠在果汁 中分散均勻，加膠后繼續(xù)在30°C攪拌2h。將果汁均質(zhì) 萬方數(shù)據(jù)(30MPa)，裝瓶后在10(TC中殺菌lOmin，逐級(jí)冷卻。在 室溫下避光儲(chǔ)藏。不加膠的果汁只加相應(yīng)量的蔗糖。

 

1.5測(cè)定方法1.5.1沉淀物中總碳水化合物（總糖）含量的測(cè)定稱 0.0197g沉淀物，加入2ml2M的三氟乙酸(TFA)，在高 壓滅菌鍋內(nèi)水解75min(12rC)，過濾，收集濾液并用去 離子水洗殘?jiān)鼣?shù)遍，合并濾液，揮去三氟乙酸，用 INNaOH調(diào)pH至7.0左右，定容至15ml。用苯酚-硫 酸法測(cè)總糖，用葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以葡萄糖計(jì)。 1.5.2沉淀物中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用凱氏定氮法測(cè) 定1.5.3沉淀物中多酚含量的測(cè)定精確稱取0.0375g沉淀 物，加入4ml60%的甲醇(V/V)，在室溫提取lh后離心 15min(9000rpm/min)，取上清按文獻(xiàn)[5]同用福林-肖卡 法]測(cè)總釀含量，用香草醛-鹽酸法定A環(huán)為間苯三 酚的黃烷醇和聚原花色素的含量，用正丁醇-鹽酸法^ 測(cè)定聚原花色素的含量。

 

1.5.4沉淀物中蛋白質(zhì)氨基酸組成分析用自動(dòng)氨基酸 分析儀測(cè)定。精確稱樣品20mg用6mol/L鹽酸于110°C 水解24h,將水解液處理后蒸干（約40°C),加入 0.02mol/L鹽酸2ml，此液上機(jī)測(cè)定氨基酸含量。

 

色譜條件：離子交換柱：2.6X 150mm 流速：0.225ml/min可見光檢測(cè)器：波長(zhǎng)570nm;440nm (Pro，Hypro)

 

流動(dòng)相：檸檬酸和檸檬酸鈉的緩沖液 進(jìn)樣量：5〇M 11.5.5蛋白質(zhì)的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝肢電泳 法(SDS-PAGE)分析⑴貯液及凝膠溶液的配制、樣品的制備和電泳操 作步驟參照文獻(xiàn)m ⑵電泳條件：分離膠和濃縮膠的濃度分別為20%和5%，樣品和 標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子量蛋白的上樣量均為l〇Ml，電泳過程恒 流10mA，電泳時(shí)間4h左右。從玻璃板剝離的膠用20% (W/V)的三氯乙酸固定30min后，用0.1%考馬斯亮 R-250染色2h，脫色后拍照。

 

1.5.6沉淀物中酚類的HPLC分析用1.5.4中樣品用 HPLC分析酚類，條件同見文獻(xiàn)同。

 

1.5.7單寧-鐵復(fù)合物的定性檢測(cè)曰取少許沉淀，加入 1.5ml的5%的硫酸溶液，液體為淺紅色。在100°C水浴 中加熱20s，如液體為深紅色，證明沉淀中含有單寧-鐵 復(fù)合物。

 

1.5.8果汁濁度、果汁粘度、果汁中果肢含量和懸浮顆粒Zeta電位和的測(cè)定見文獻(xiàn)PI2結(jié)果與討論2.1沉淀物的基本組成為了研究沉淀物中酚類物質(zhì)的特性，將沉淀物的甲 醇提取液進(jìn)行HPLC分析。將沉淀物甲醇提取物的HPLC圖(圖1)與標(biāo)樣在相同條件下的HPLC圖對(duì)比發(fā) 現(xiàn)，沉淀物含有5-羥甲基糠醛(5-HMF)等VC降解產(chǎn) 物(保留時(shí)間為6.316min,)、表兒茶素(26.600min)及根 皮苷(55.607min)。

 

此外，沉淀物遇碘液變藍(lán)表明其中含有淀粉。沉淀物與5%硫酸溶液在100°C水浴中加熱20s后液體為深 紅色，表明沉淀中含有單寧-鐵復(fù)合物A最后，綜合定 性、定量測(cè)定結(jié)果，將沉淀物中主要成分及部分成分的 含量總結(jié)于表1。

 

澄清果汁在儲(chǔ)藏過程中的混濁物如以酚類、蛋白質(zhì) 為主要成分，酚類在混濁物中的質(zhì)量比例一般在45.7% ?75.8% (正丁醇-HC1 法)，蛋白質(zhì)為 11.4%~29.05%[w]; 由表1,混濁蘋果汁沉淀物的主要成分為蛋白質(zhì) (55.2%)和多糖(26.2%),蛋白質(zhì)占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。也含有 酚類、單寧-鐵復(fù)合物和HMF，但他們含量相對(duì)較少， 如酚類所占質(zhì)量比例僅僅1.72%，所以蛋白質(zhì)-多酚結(jié) 合物可能不是沉淀物的主要成因。在混濁蘋果汁的沉淀 物中發(fā)現(xiàn)的縮合單寧、單寧-鐵復(fù)合物和淀粉等又是組 成澄清蘋果汁的混濁物的成分。這就驗(yàn)證了筆者提出的 推斷：混濁蘋果汁可看成為把一些顆粒(含蛋白質(zhì)、果膠 等)加入到澄清蘋果汁中后的混合物?；鞚崽O果汁儲(chǔ)藏 過程中顆粒的成長(zhǎng)包含了類似澄清蘋果汁在儲(chǔ)藏過程 中產(chǎn)生混池物這一因素，但其占比例較小?；鞚崽O果汁表1沉淀物的成分分析結(jié)果成分含量（w/wxl00%)

 

蛋白質(zhì)55.20總糖26.20果膠1.71酚類總酚1.72綠原酸0.14縮合單寧及其單體1.53縮合單寧1.32根皮苷單寧-鐵復(fù)合物5-HMF注：測(cè)定方法見實(shí)驗(yàn)部分。

 

萬方數(shù)據(jù)中的蛋白質(zhì)與果膠和/或蛋白質(zhì)與其他多糖形成的顆 粒的聚集長(zhǎng)大可能為沉淀物形成的主要因素。

 

在沉淀物中也檢測(cè)出了 VC的降解中間產(chǎn)物(圖1 中峰1-3)。表明VC降解后不但產(chǎn)生可溶性色素，也會(huì) 產(chǎn)生不溶性色素，這些色素的形成往往需要其他物質(zhì) (如游離氨基酸)參與[11]。

 

鑒于沉淀物中蛋白質(zhì)為主要成分，下面對(duì)其進(jìn)一 步研究。

 

2.2沉淀物中蛋白質(zhì)的特性2.2.1相對(duì)分子質(zhì)量通過SDS-PAGE技術(shù)測(cè)定的蛋白 質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的圖譜見圖2。將樣品的相對(duì)遷移率帶 入標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明沉淀物含有25507Da和 40443Da等相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)條帶。

 

關(guān)于清汁二次沉淀物中蛋白質(zhì)的研究表明，無論是 在蛋白質(zhì)-多酚沉淀，還是在多糖-蛋白質(zhì)沉淀中，相對(duì) 分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)均起重要作用，如蘋果汁中蛋白 質(zhì)-多酚沉淀物蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為21~31kDa['筆 者研究發(fā)現(xiàn)在混濁蘋果汁的瓶底沉淀物中的25507Da 的蛋白質(zhì)與報(bào)道的蛋白質(zhì)的對(duì)分子質(zhì)量相一致。 25507Da的蛋白質(zhì)通過形成蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物參與 沉淀，這驗(yàn)證了混濁蘋果汁的瓶底沉淀物包含類似清汁 后混濁的這部分蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物。此外，沉淀物中 還發(fā)現(xiàn)了在蘋果清汁后混濁中不曾報(bào)道的40443Da的 蛋白質(zhì)，它們?cè)跐嶂型ㄟ^不同形式參與形成懸浮顆 粒。在電泳圖譜中，40443Da的蛋白質(zhì)條帶最明顯，表明 這種分子量的蛋白質(zhì)含量較多。

 

2.2.2蛋白質(zhì)中氨基酸組成分析關(guān)于澄清果汁混濁活性蛋白的研究表明，脯氨酸、羥脯氨酸和甘氨酸等疏水 性氨基酸含量較高的蛋白質(zhì)更易與酚類結(jié)合形成混濁 物而混濁蘋果汁瓶底沉淀物的蛋白質(zhì)中脯氨酸含量 僅為5.6%,沒有上清蛋白質(zhì)中的脯氨酸含量(6.6%)高 (表2)，且疏水性氨基酸含量也較少，表明混濁蘋果汁 瓶底沉淀物中的蛋白質(zhì)與形成蛋白質(zhì)-多酚混濁物的 活性蛋白組成有所不同。結(jié)合沉淀物中總酚含量?jī)H為 1.72%,分析認(rèn)為蛋白質(zhì)-多酚復(fù)合物不是混濁蘋果汁 儲(chǔ)藏中形成瓶底沉淀的主要原因。

 

2.3肢添加量的確定考慮到混濁蘋果汁中的懸浮顆粒整體帶負(fù)電荷的 特點(diǎn)[1]，筆者選取了兩種帶負(fù)電的膠一竣甲基纖維素 (CMC)和卡拉膠以及一種粘度最大的膠一瓜爾膠來進(jìn) 行實(shí)驗(yàn)。CMC溶液具有高粘性和穩(wěn)定的傾向，能穩(wěn)定蛋表2蘋果汁上部和沉淀物中蛋白質(zhì)的氨基酸組成三字英文符氨基酸中文名稱蛋白質(zhì)中氨基酸占總氨基酸的質(zhì)量百分比(％>瓶上部果汁瓶底沉淀物Asp天冬氨酸10.19.6Glu谷氨酸15.413.8Ser絲氨酸5.75.0His組氨酸2.92.6Gly甘氨酸5.34.7Thr蘇氨酸5.14.8Ala丙氨酸2.92.9Arg精氨酸10.310.5Tyr酪氨酸3.24.0Cys-s半胱氨酸0.50.5Val纈氨酸7.87.iMet蛋氨酸0.31.4Phe苯丙氨酸4.95.2He異亮氨酸4.45.3Leu亮氨酸7.79.2Lys賴氨酸6.97.8Pro脯氨酸6.65.6白質(zhì)分散體系瓜爾膠是所有天然的商品膠中粘度最 髙的一種膠，其主要成分為半乳甘露聚糖，它不帶電 荷％。卡拉膠是幾種相關(guān)的在糖單位上連接硫酸一酯基 的半乳聚糖的混合物，硫酸一酯即使在強(qiáng)酸條件下也總 是離子化的，因此分子帶負(fù)電荷％。

 

將實(shí)驗(yàn)用膠按0.025%、0.05%和0.100%(W/V)三種 水平添加，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.025%的添加量對(duì)果 汁混池穩(wěn)定性的影響較小，達(dá)不到較好的效果。0.1%的 添加量明顯增加了果汁的粘度，果汁的混濁穩(wěn)定性得到 較好的改善，但是果汁品嘗時(shí)有稠感。最終選定0.05% 的添加量。

 

2.4膠的添加對(duì)果汁混濁穩(wěn)定性的影響筆者用兩種方法來衡量果汁的混濁穩(wěn)定性。一種 是在離心前測(cè)定果汁的濁度，經(jīng)過離心后再測(cè)定果汁的 濁度，計(jì)算出離心后濁度的保留率，保留率大者則混濁 穩(wěn)定性高。第二種是把離心過程換為真實(shí)的儲(chǔ)藏實(shí)驗(yàn)， 測(cè)定儲(chǔ)藏前和儲(chǔ)藏后果汁的濁度，用二者計(jì)算出儲(chǔ)藏后 果汁濁度的保留率，保留率大者則混濁穩(wěn)定性高。兩種 方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。離心法用時(shí)短，偏重從果汁粘度和果 汁中現(xiàn)有顆粒尺寸兩方面來考察果汁的混濁穩(wěn)定性，但 不能考察果汁在貨架期內(nèi)果汁中顆粒的長(zhǎng)大和果汁粘 度降低等潛在的影響因素下的真實(shí)的混濁穩(wěn)定性，與實(shí) 際情況還有一定差距。儲(chǔ)藏實(shí)驗(yàn)法用時(shí)較長(zhǎng)，需要儲(chǔ)藏 設(shè)備，但考慮了現(xiàn)實(shí)因素，接近真實(shí)，結(jié)果可靠。

 

由表3,用方法1得到的果汁混池穩(wěn)定性次序?yàn)椋?添加瓜爾膠（保留率28.7%)>添加CMC (保留率 25.0%)>添加卡拉膠（保留率19.2%)>對(duì)照（保留率 17.5%)?？梢娞砑幽z可不同程度地改善果汁的混濁穩(wěn)定 性。由表4,添加膠后果汁的粘度都比對(duì)照髙，添加瓜爾 膠的果汁的粘度最高(2.444mPa.S)。由于方法1著重從 果汁的粘度來考察果汁的混濁穩(wěn)定性，所以用這種方法 得到的果汁混濁穩(wěn)定性的次序正好和果汁粘度的大小 次序相同。

 

由表3,用方法2得到的果汁混濁穩(wěn)定性次序?yàn)椋?添加CMC (保留率38.8%)>添加瓜爾膠（保留率 35.3%)>對(duì)照（保留率33.5%)>添加卡拉膠（保留率 15.4%)。添加卡拉膠的果汁在儲(chǔ)藏中發(fā)生了嚴(yán)重的絮凝 和分層。CMC是帶負(fù)電荷的，加入蘋果汁后可與帶正電 荷的蛋白質(zhì)結(jié)合為更穩(wěn)定的顆粒結(jié)構(gòu)，增加果汁中顆粒 的負(fù)電荷攜帶量，從而使懸浮顆粒間產(chǎn)生強(qiáng)的靜電斥 力。表現(xiàn)為添加CMC的果汁有最大的zeta電位(-22. 8)，明顯大于添加瓜爾膠的(-15.4)。因此，在果汁的粘度 隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，顆粒尺寸因素取代粘 度因素成為影響果汁混濁穩(wěn)定性的主要因素時(shí)，添加___http://www.casb.ore.cn表3膠的添加對(duì)果汁混濁穩(wěn)定性的影響狀態(tài)對(duì)照添加CMC添加瓜爾膠添加卡拉膠濁度a濁度保留率濁度濁度保留率濁度濁度保留率濁度濁度保留率殺菌前1.2461.2501.2641.240殺菌后1.254100.6%1.24099.20%1.273100.7%1.247100.6%殺菌后（果汁經(jīng)離心、0.22017.5%0.31025.0%0.36528.7%0.23919.2%儲(chǔ)藏120d后0.42033.5%0.48138.8%0.44935.3%0.19215.4%注：離心條件為：420〇x g離心15mina指OD細(xì)結(jié)果為三個(gè)數(shù)據(jù)的平均值。

 

表4膠的添加對(duì)果汁粘度和zeta電位的影響對(duì)照添加CMC添加瓜爾膠添加卡拉膠粘度（mPa.s)1.2602.0312.4441.383zeta 電位（mV)-16.3-22.8-15.4?16.2注：結(jié)果為三個(gè)數(shù)據(jù)的平均值。

 

CMC的果汁由于懸浮顆粒間具有強(qiáng)的靜電斥力而阻滯 了顆粒由于聚集引起的尺寸長(zhǎng)大，使果汁的混濁穩(wěn)定性 最好。添加瓜爾膠的果汁雖然粘度最大，但瓜爾膠是不 帶電荷的，不能象CMC那樣有效地阻止果汁中顆粒尺 寸的長(zhǎng)大。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，果汁中顆粒逐漸聚集 長(zhǎng)大，而果汁粘度逐漸降低，顆粒沉降速率加快，使果汁 的混濁穩(wěn)定性差于加CMC的果汁。由于對(duì)照的Zeta電 位與加瓜爾膠的差別不大，其粘度又小于加瓜爾膠的果 汁，故其穩(wěn)定性稍差。綜上所述，在添加量相同的條件 下，CMC是較好的穩(wěn)定混濁蘋果汁的添加劑。 Genovese13]在研究混池蘋果汁混池穩(wěn)定性的改善時(shí)，在 與黃原膠等膠對(duì)比后，同樣指出CMC是最有效的改善 混濁蘋果汁穩(wěn)定性的添加劑，也同樣歸因于其帶負(fù)電而 增大了蘋果汁的Zeta電位。

 

由于卡拉膠有與蛋白質(zhì)反應(yīng)的性質(zhì)，特別是與牛乳 蛋白相互作用。K-型卡拉膠就可與牛乳的酪蛋白膠束 復(fù)合形成一種弱的凝膠[141。筆者的研究顯示卡拉膠能夠 與蘋果中某種蛋白反應(yīng)，形成凝膠，在瓶底可見絮狀物， 嚴(yán)重影響了蘋果汁的混濁穩(wěn)定性。但其機(jī)理有待進(jìn)一步 研究。

 

對(duì)照和大部分加了膠的果汁在殺菌后濁度有輕微 的升高(表3),這可能是由于果汁受熱導(dǎo)致其中的紛類 氧化聚合產(chǎn)生新的顆粒所致。

 

3結(jié)論沉淀物以蛋白質(zhì)為主，還含有碳水化合物、酚類(花 色苷，表兒茶素、綠原酸、單寧等)、5-羥甲基糠醛 (HMP)等VC降解產(chǎn)物，成分很復(fù)雜。沉淀物主要是由 果汁中原有的顆粒聚集長(zhǎng)大下沉產(chǎn)生，酚類物質(zhì)氧化聚 合后與蛋白質(zhì)和氨基酸等物質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生的新的小顆粒 以及類似蘋果清汁中的后混濁的因素也存在，但不是主 要因素。添加CMC主要是通過提高果汁的粘度和果汁 中懸浮顆粒的zeta電位來改善混濁蘋果汁的混濁穩(wěn)定 性。添加瓜爾膠主要是通過提高果汁的粘度來改善混濁 蘋果汁的混濁穩(wěn)定性。在CMC、瓜爾膠和卡拉膠的添加 萬方數(shù)據(jù) 量都為0.05%(W/V)的條件下，CMC改善果汁的混濁 穩(wěn)定性的效果最好，瓜爾膠次之，卡拉膠不但不起穩(wěn)定 作用，反而會(huì)使果汁在儲(chǔ)藏過程中造成嚴(yán)重的分層。

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