由于半乳甘露低聚糖的最適溫度為501C,故選擇 50T作為最適酶解溫度，以0.3%瓜爾膠為底物，以底 物的酶解率為指標(biāo)，以加酶量（U • g^kpH值和酶解 時(shí)間為影響因素，進(jìn)行L1S(43)3因素4水平正交實(shí) 驗(yàn)，通過(guò)極差分析和實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳酶解條件。
1.4半乳甘露低聚糖產(chǎn)率的測(cè)定
在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)完畢在沸 水中將酶滅活，酶解液過(guò)濾，移至超濾裝置中，在0.2 MPa的壓力下，使用截留分子量為1000 Da的超濾膜 截取分子量<1000 Da的寡糖。收集超濾透過(guò)液，濃 縮，冷凍，干燥，即得GMOS干粉，準(zhǔn)確稱取其質(zhì)量。 按式(2)計(jì)算GMOS的產(chǎn)率。
產(chǎn)率祕(mì) 1.S酶解產(chǎn)物的表征
用時(shí)間飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF)鑒定酶解產(chǎn)物的 分子量和聚合度。質(zhì)譜儀的氮激光器波長(zhǎng)337 rnn，采 用延時(shí)引出（Delayed extraction)和反射（Ref lection ) 的工作方式，加速電壓19. 5 kV，反射電壓20 kV，延 時(shí)引出電壓14. 5?16.5 kV,延時(shí)時(shí)間50?200 ns，正 離子檢測(cè)。.
用核磁共振碳譜(13CNMR)對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu) 表征。并用高效液相色譜法（HPLC)檢測(cè)酶解產(chǎn)物中 各組分的含量，色譜條件：色譜柱NH2 Column U16 mmX250 mm),柱溫 30X：,流速 1 mL • min一】，進(jìn)樣 量為20 pL,流動(dòng)相乙腈••水=75 : 25。根據(jù)GMOS 保留時(shí)間定性，色譜峰面積歸一化法定量。
2結(jié)果與討論
2.1正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
按照L1S(43)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)方案，測(cè)定了不同條件 下瓜爾膠的酶解率，結(jié)果見(jiàn)表1。
從表1的極差分析可以看出，各因素對(duì)瓜爾膠酶 解率的影響大小依次為:pH值>加酶量>酶解時(shí)間。 最佳酶解條件為：pH值7.0、酶解時(shí)間10 h、加酶量 40 U . g-1。
2.2半乳甘露低聚糖的產(chǎn)率測(cè)定
在上述最佳酶解條件下，對(duì)1000 mL 0. 3%瓜爾 膠液進(jìn)行酶解反應(yīng)，酶解液通過(guò)截留分子量1000 Da 的超濾膜，透過(guò)液經(jīng)濃縮，凍干，得到GMOS干粉
1.27 g。按式(2)計(jì)算，GMOS的產(chǎn)率為42. 3%»
2.3半乳甘露低聚糖的結(jié)構(gòu)表征
2.3.1 MALDI-TOF 分析
片甘露聚糖酶酶解產(chǎn)品（未經(jīng)超濾）的MALDI- TOF譜圖見(jiàn)圖1。
50010001500200025003000
mfz
圖1半乳甘露低聚糖的時(shí)間飛行質(zhì)進(jìn)圖 Flg.1 The MALDI-TOF spectrnm of GMOS
由圖1可看出，質(zhì)譜峰的質(zhì)核比分別是527. 5、 689. 5、851. 6、1013. 7、1175.8、1337. 8、1499.9、 1662. 0、1824. 0、1986. 1、2149. 1，一共 11 個(gè)峰。
在GMOS分子中，每個(gè)結(jié)構(gòu)單元是一個(gè)單糖（甘 露糖或半乳糖)殘基，其質(zhì)量數(shù)是162,因此，質(zhì)譜峰的 荷質(zhì)比(m/z)可表示為:m/z=18 + 162X« + Na+,其 中《表示單糖數(shù)目、Na+是與低聚糖結(jié)合的鈉離子。 由于設(shè)備的最小量程是500 wt/z，所以圖譜中沒(méi)有單 糖和雙糖的分子離子峰，該圖的質(zhì)譜峰值從527. 5開(kāi) 始。各峰之間相差162,與已知單元是一個(gè)單糖（甘露 糖或半乳糖)殘基相符合。從第一個(gè)峰（527. 5)開(kāi)始， 其聚合度為3(三糖），此后每個(gè)峰遞增1個(gè)聚合度，直 至最后的質(zhì)譜峰(2149.1)為十三糖。
2. 3. 2 13CNMR 分析
GMOS的13CNMR譜圖如圖2所示。
為了區(qū)別不同類型的碳，其中甘露糖基用man表 示，半乳糖基用gal表示，圖2中各種碳的化學(xué)位移如
ppm信號(hào)峰外（帶OH的C),還有一個(gè)69.417 ppm 的信號(hào)峰，這是C6通過(guò)糖苷鍵與支鏈上的半乳糖相連 后，其化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)的結(jié)果。
(3)降解產(chǎn)物的Q-man除了出現(xiàn)一個(gè)75.658 ppm信號(hào)峰外（帶OH的C),還有一組79. 429 ppm、 79. 300 ppm、79. 063 ppm的信號(hào)峰，這是甘露糖基C4 通過(guò)糖苷鍵與甘露糖相連后，受支鏈上半乳糖的空間 結(jié)構(gòu)影響，其化學(xué)位移向低場(chǎng)移動(dòng)的結(jié)果。
13CNMR譜說(shuō)明酶解產(chǎn)物是一種在主鏈D■甘露 糖基Cs上通過(guò)糖苷鍵連接1個(gè)半乳糖殘基支鏈的半 乳甘露低聚糖，其結(jié)構(gòu)與帶有葡萄糖支鏈的葡甘露低 聚糖不同。而與Vieira等⑷的研究結(jié)果基本一致。
甘露糖、甘露二糖、甘露三糖和甘露四糖標(biāo)準(zhǔn)品的 保留時(shí)間分別為 5. 225 min、6. 822 min、8. 102 min、 9. 678 min。在降解產(chǎn)物HPLC譜圖中沒(méi)有甘露糖的 峰，說(shuō)明酶解產(chǎn)物幾乎沒(méi)有單糖。保留時(shí)間為6. 8M min的峰與甘露二糖（6. 822 min)相似，說(shuō)明它是二 糖，以此類推其后4個(gè)峰分別是三糖、四糖、五糖和六 糖。因?yàn)榻到猱a(chǎn)物已經(jīng)用截留分子量為1〇〇〇 Da的超 濾膜分離過(guò)，七糖以上的組分已被截留，因此，只有六
糖以下的組分。
Emis等[9]和Shimahara等[1°]研究證明，片甘露聚 糖酶作用于魔芋膠或槐豆膠的作用位點(diǎn)是多糖鏈的非 還原端的第3或第4個(gè)糖分子。雖然不同來(lái)源的牙甘 露聚糖酶對(duì)底物的作用深度不同，但主要產(chǎn)物是甘露 低聚糖，相對(duì)來(lái)說(shuō)，很少產(chǎn)生單糖。本研究的結(jié)果與其 相似。
3結(jié)論
用矛甘露聚糖酶酶解瓜爾膠制備了功能性低聚 糖——半乳甘露低聚糖。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)得到了在底物 濃度〇. 3%、50T：下的最佳酶解條件為：pH值7. 0、酶 解時(shí)間10 h、加酶量40 U • (g瓜爾膠廠1。在此條件 下進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，經(jīng)超濾分離，得到聚合度2?10的產(chǎn) 品，產(chǎn)率為42.3%。通過(guò)MALDI-TOF質(zhì)譜分析證 明，酶解液超濾之前的GMOS組分主要由2?10個(gè)單 糖組成，但經(jīng)過(guò)截留分子量為1000 Da的超濾膜處理 后，酶解液的組分主要由二糖、三糖、四糖、五糖、六糖 組成。通過(guò)13CNMR確定，本實(shí)驗(yàn)酶解產(chǎn)品是一種在 主鏈D■甘露糖基Cs上通過(guò)糖苷鍵連接1個(gè)半乳糖支 鏈的半乳甘露低聚糖，其結(jié)構(gòu)與葡甘露低聚糖有所不同。