濕熱復(fù)合改性對(duì)谷朊粉巰基雙硫鍵的影響,蛋白質(zhì)是由氨基酸聚合而成的大分子化合物，廣泛存在于各種生物體中，它 是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。二硫鍵是一種共價(jià)鍵，它對(duì)蛋白質(zhì)的空間折疊和高級(jí)結(jié) 構(gòu)的形成與維持十分重要。二硫鍵的形成迫使同—肽鏈或不同肽鏈的不同區(qū)域的 氨基酸殘基向一起靠攏聚合，由此肽鏈迅速折疊并形成穩(wěn)定的空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，該 區(qū)域內(nèi)的氨基酸殘基數(shù)量是高度密集的；同時(shí)疏水氨基酸殘基圍繞著二硫鍵，可 形成局部疏水中心，拒絕水分子進(jìn)入肽的內(nèi)部破壞氫鍵，利于形成穩(wěn)定的髙級(jí)結(jié) 構(gòu)區(qū)域。由于二硫鍵可以橋接肽鏈的不同區(qū)域，有時(shí)候也被稱為二硫橋（disulfide bridge) w’64]。巰基是半胱氨酸的殘基，是所有蛋白質(zhì)氨基酸殘基中最活潑的集 團(tuán)，蛋白質(zhì)分子中兩個(gè)半胱氨酸殘基的巰基基團(tuán)可以發(fā)生氧化反應(yīng)形成二硫鍵， 二硫鍵雖然是共價(jià)鍵，但并不十分牢靠，很容易被還原而斷裂，斷裂后可以再次 氧化，重新形成二硫鍵。當(dāng)二硫鍵被斷開(kāi)還原為巰基基團(tuán)時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)必然發(fā) 生改變。因此，二硫鍵是動(dòng)態(tài)變化的，只具有相對(duì)的穩(wěn)定性，濕熱復(fù)合改性對(duì)谷朊粉巰基雙硫鍵的影響,這一特征與氦基酸 氮原子間形成的十分牢靠的共價(jià)鍵不同。
本試驗(yàn)研究了果膠、海藻酸鈉、明膠、羧甲基纖維素鈉和瓜爾膠在濕熱條件 下對(duì)谷朊粉自由巰基和二硫鍵含量的影響。
5.2材料與方法 5.2.1試驗(yàn)材料與試劑
谷朊粉，果膠-谷朊粉復(fù)合物，CMC-谷朊粉復(fù)合物，海藻酸鈉-谷朊粉復(fù)合物， 明膠-谷朊粉復(fù)合物，瓜爾膠-谷朊粉復(fù)合物分別按照第二章所述獲得；EDTA二鈉， Ellman試劑，尿素，三氯乙酸，巰基乙醇，Tris，甘氨酸。
5.2.2儀器
分光光度計(jì)，離心機(jī)，恒溫水浴鍋。
5.2.3試驗(yàn)方法
5.2.3.1自由巰基（"SH)含量的測(cè)定
首先按下列要求配置試劑：
(1)1'1^-^7緩沖液：精確稱取1'1^10.418克，甘氨酸6.75克，£074二鈉
1.48克，加蒸餾水定容至1000ml,調(diào)節(jié)pH到PH8。
(2) Tris-Gly-8MUrea 溶液：在 70mlTris-Gly 緩沖液中加入尿素 48.048 克，
定容至100ml。
(3)Ellman試劑(4mg/ml):稱取400毫克5, 5-二硫代雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)
溶于Tris~Gly緩沖液，并定容至100ml。
實(shí)驗(yàn)步驟如下：
吸取0.5ral溶度為15mg/ml的谷朊粉溶液加入試管，然后向試管中加入2. 5ml Tris-Gly-8MUrea溶液，再加入〇.〇2mlEllman試劑，迅速混勻后在25’C下保溫反 應(yīng)，30分鐘后用分光光度計(jì)測(cè)定其在X=412nm處的吸光度值，空白值用蒸餾水代 替樣品測(cè)定，每組三個(gè)重復(fù)，取平均值為最終結(jié)果。計(jì)算公式如下所示： umol SH/g=73.53XA4l2XD/C 公式中：A«2為人=412nm下吸光度值；
D為稀釋系數(shù)；
C為樣品的蛋白質(zhì)最終濃度，單位為mg/mL。
5.2.3.2雙硫鍵（S>S)含量的測(cè)定
首先配置好8mol/L脲試劑、12%的TCA試劑和4mg/ml的Ellman試劑，濕熱復(fù)合改性對(duì)谷朊粉巰基雙硫鍵的影響,然后 吸取0. 5ml溶度為15mg/ml的谷朊粉溶液加入10ml離心試管，接著加入〇. 〇5ml 巰基乙醇和2ml脲試劑，混勻后于25°C下保溫1小時(shí)；之后加入5mlTCA試劑繼 續(xù)于25，C下保溫反應(yīng)一小時(shí)；然后于5000r/min的速度下離心l〇min，除去上清 液，同法用5mlTCA洗滌沉淀兩次，最后向沉淀中加入脲試劑5ml和Ellman試劑 0.05ml，5分鐘后去上清液于處測(cè)吸光度值*空白組為5ml脲試劑，每組3個(gè) 平行，取平均值。計(jì)算公式如下：
umol(SH+還原的 SS) / g=73. 53XA«2XD / C. umol(S-S〉/g=(總巰基含量-游離巰基含量）/2
5.3結(jié)果與討論
巰基和二硫鍵的含量與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能有著非常密切的聯(lián)系，巰基在氧 化條件下易形成雙硫鍵，使蛋白質(zhì)分子間發(fā)生交聯(lián)從而形成髙分子量的聚合物[55]。 但這種雙硫鍵并不牢固，很容易被還原而斷裂，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，使 蛋白質(zhì)的功能特性發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)果膠改性的谷朊粉，其自由巰基 的含量與未處理的谷朊粉相比，增加了 50. 5%,而二硫鍵的含量卻只有2.37mol/g， 降低了 94.64%;經(jīng)海藻酸鈉改性的谷朊粉，其自由巰基的含量與未處理的谷朊粉 相比，增加了 27.44%，二硫鍵的含量降低了 22.43%;經(jīng)明膠改性的谷朊粉，其自 由巰基的含量與未處理的谷朊粉相比，增加了 18.51%,二硫鍵的含量降低了 36.34%;經(jīng)羧甲基纖維素鈉改性的谷朊粉，其自由巰基的含量與未處理的谷朊粉 相比，增加了 14.14%,二硫鍵的含量降低了 48.39%;經(jīng)瓜爾膠改性的谷朊粉，其 自由巰基的含量與未處理的谷朊粉相比，增加了 29.46%，二二硫鍵的含量降低了 57.81%?？傮w來(lái)看，經(jīng)膠體改性后的谷朊粉，其二硫鍵的含量均有所減少，表明 谷朊粉蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)減少，分子間的聚合程度降低，從而使蛋白質(zhì)分子的 表面活性增強(qiáng)。從谷朊粉蛋白質(zhì)功能性質(zhì)方面來(lái)看，就是谷朊粉溶解性、乳化性、 起泡性等功能性質(zhì)的提高。
還原成自由巰基，二硫鍵減少，蛋白質(zhì)分子發(fā)生解離，分子量減小，濕熱復(fù)合改性對(duì)谷朊粉巰基雙硫鍵的影響,這可能是谷 朊粉改性后溶解性增大的原因所在?？偟膸€基含量的降低原因可能是巰基和膠體 的某些集團(tuán)發(fā)生交聯(lián)，使其不能被檢測(cè)出來(lái)。
S
5.4本章小結(jié)
通過(guò)對(duì)改性前后谷朊粉的自由巰基和二硫鍵含量的測(cè)定分析，除瓜爾膠外， 其他四種膠體對(duì)谷朊粉進(jìn)行改性后，其自由巰基含量都有所增加，所有改性后的 谷朊粉的二硫鍵含量都有降低，其二硫鍵含量從大到小依次為：海藻酸鈉-谷朊粉 復(fù)合物、明膠-谷朊粉復(fù)合物、羧甲基纖維素鈉-谷朊粉復(fù)合物、瓜爾膠-谷朊粉復(fù) 合物、果膠-谷朊粉復(fù)合物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明濕熱條件下膠體對(duì)谷朊粉的改性使谷朊 粉中二硫鍵減少，蛋白質(zhì)分子間的聚合度降低，蛋白質(zhì)分子的表面活性增大，從 而使谷朊粉溶解性、乳化性、起泡性等功能性質(zhì)都得到一定的改善。
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