聚糖和半乳葡甘露聚糖的主鏈內(nèi)部隨機(jī)切割卩甘露 糖苷鍵的水解酶，簡(jiǎn)稱P-甘露聚糖酶(p-manminase)w ,廣泛 存在于動(dòng)植物和微生物中。據(jù)文獻(xiàn)[3]報(bào)道，某些植物膠(如 魔芋膠、角ii膠、瓜爾豆膠、田菁膠等）經(jīng)p•甘露聚糖酶水解 后的產(chǎn)物含有不同單糖分子組成的低聚糖。

半乳甘露低聚糖（galactomannan-o 丨 igosaccharides，簡(jiǎn)稱 GMOS)是低聚糖家族的新成員，是半乳甘露聚糖的不完全 降解產(chǎn)物,它能顯著增進(jìn)人體腸道內(nèi)以雙歧桿菌為代表的有 益南的增殖,且具有減少動(dòng)物腸道病原菌、增強(qiáng)免疫、提高腸 黏膜功能等多種特性目前，在日本已有以瓜兒膠為原 料制備的甘露低聚糖功能食品，但中國(guó)多是用魔芋膠制取葡 甘露低聚糖，而且對(duì)由瓜爾膠制備半乳甘露低聚糖的研 究較少。隨著瓜爾豆在中國(guó)的推廣種植[11]，用瓜爾膠為原 料制備半乳甘露低聚糖將會(huì)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本試驗(yàn) 采用甘露聚糖酶對(duì)瓜兒膠進(jìn)行酶解，優(yōu)化酶法制備半乳甘 露低聚糖的工藝條件，并對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行定性檢測(cè)，旨在為 產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

瓜爾膠:廣東大地食用化工有限公司；

P-甘露聚糖酶:昆明愛科特生物科技有限公司；

甘露糖、甘露二糖:廣州市齊云生物技術(shù)有限公司； 其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

定時(shí)恒溫磁力攪拌器：90-2型，上海滬西分析儀器有限 公司；

數(shù)字旋轉(zhuǎn)黏度計(jì):SNB4型，上海恒平科學(xué)儀器有限公司； 可見光分光光度計(jì):JH 722S型，上海菁華科技儀器有 限公司；

高效液相色譜分析儀jhimadzu LC-20AT型，日本島津 公司；

不差折光檢測(cè)器：RII>l〇A型，日本島津公司。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1 p■甘露聚糖酶活力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[12]。取0.5% 的瓜爾膠溶液(pH 5.0的磷酸氫二鈉一檸橡酸緩沖液配置) 20 mL,加人0.1 mL用pH 5.0緩沖液配置的粗酶液，于 50X：反應(yīng)30min，用DNS法測(cè)還原糖量。在上述試驗(yàn)條件 下，以每分鐘水解底物產(chǎn)生1 /imol還原糖（以甘露糖計(jì)）所 需的酶量定義為一個(gè)P-甘露聚糖酶酶活單位（IU/gh 1.3.2黏度測(cè)定采用SNB—1數(shù)字旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)。

1.3.3瓜爾膠總糖測(cè)定準(zhǔn)確稱取0.05 g瓜爾膠置于 20 mL具塞試管內(nèi)，酶法制備瓜爾膠半乳甘露低聚糖的研究，依次加人10 mL水和0.4 mL濃硫酸，于 100 t水解2 h,冷卻后用NaOH中和，然后定容100 mL。 取1. 0 mL用DNS法測(cè)定還原糖（以甘露糖計(jì))量，計(jì)算總糖 量，總糖含量按公式（1)計(jì)箅：

瓜爾膠總糖含量= =^^^^X100%(1)

1.3.4瓜爾膠酶解率不同濃度的瓜爾膠溶液中加人一定 活力單位的P-甘露聚糖酶(加酶量以IU/g瓜爾膠計(jì)），于不 同溫度下反應(yīng)一定時(shí)間，取樣適當(dāng)稀釋后用DNS法測(cè)定酶 解液中的還原糖(以甘露糖計(jì))量。酶解率按公式(2)計(jì)算：

瓜爾膠酶解率= U^^^X100%(2)

1.3.5平均聚合度（DP)聚合度為寡糖中組成寡糖的單 糖單位的個(gè)數(shù)[13]。半乳甘露低聚糖的DP按公式(3)計(jì)算：

平均聚合度(DP) =酶雜雜暈XI。。%(3)

1.3.6酶解產(chǎn)物高效液相色譜定性檢測(cè)酶解液加入2倍 體積的無水乙醇，靜置后離心，取上清液，濃縮，采用高效液 相色譜儀定性分析。色譜條件：色譜柱Kromasil 100-5NH2 (150X4.6 mm),柱溫 40 X：,流速 1 mL/min,進(jìn)樣量 20 pL， 流動(dòng)相為乙腈 > 水=70 : 30,示差折光檢測(cè)器分析。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1單因素試驗(yàn)以酶解率和DP為指標(biāo)，依次分別對(duì)加 酶量、底物濃度、酶解溫度.pH值和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行單因素試 驗(yàn)。在0.5%的瓜爾膠溶液中分別加人10,15,20,25,30, 40 IU/g的p-甘露聚糖酶，于pH 5. 0,50 t：反應(yīng)30 min,以確 定最佳加酶鼂；分別配置濃度為〇. 25%、0. 5%,1. 0%、 1,5%、2.0%的瓜爾膠溶液，各加入p-甘露聚糖酶20 IU/g， 于pH 5.0,50 1C反應(yīng)30 min,以選擇合適的底物濃度；在

0.5%的瓜爾膠溶液中加人20 IU/g p•甘露聚糖酶，分別在 pH 5.0,溫度分別為 30,40,45,50,55,60,70,80 t：的條件下 反應(yīng)30 min,以確定合適的反應(yīng)溫度；分別用pH 4. 0,5. 0, 6.0,7. 0,8. 0的緩沖液配置〇• 5%的瓜爾膠溶液，各加人 2〇 IU/g卩-甘露聚糖酶，于50 *C反應(yīng)30 min,以選擇最佳 PHUO. 5%的瓜爾膠溶液加人20 IU/g p-甘露聚糖酶， pH 5.0,50 t進(jìn)行反應(yīng)，在卜10 h內(nèi)，每間隔1 h取樣測(cè)定 酶解率，以確定合適的酶解反應(yīng)時(shí)間。每個(gè)水平重復(fù)3次， 測(cè)定結(jié)果并取平均值。

1.4.2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)由于瓜爾膠酶解過程不僅受加酶 量、底物濃度、溫度、時(shí)間、PH等因素影響，而且這些因素還 存在復(fù)雜的交互作用，故而設(shè)計(jì)L9(3<)正交試驗(yàn)，以確定酶 解瓜爾膠制備半乳甘露低聚糖的最佳條件。

2結(jié)果與分析

2.1甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以甘露糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線 (見圖1),得出回歸方程為：y = 0.012 4 1—0.016,線性相 關(guān)系數(shù)記=0.998 6。

圖1甘露糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 Figure 1 Standard curve of mannose

2.2黏度測(cè)定

瓜爾膠酶解前后的黏度變化測(cè)定結(jié)果見表1。1%的瓜 爾膠黏度為4 294 MPa • s,加人一定量|3-甘露聚糖酶后，在 5 min后,黏度迅速下降，說明p-甘露聚糖酶能很好的降解瓜 爾膠。酶法制備瓜爾膠半乳甘露低聚糖的研究，可利用這種特性，通過補(bǔ)充底物的方式獲得高濃度的 水解液。

表1酶解過程中瓜爾膠溶液的黏度變化

Table 1 The change of guar gum's viscosity

during hydrolysis

時(shí)間黏度AMPa. s-1)時(shí)間黏度AMFa • s M

0 min42942 h3. 334

5 min6. 6214 h2.944

10 min4. 7286 h2. 842

30 min3,5388 h2. 760

1 h3.371

2.3瓜爾膠總糖測(cè)定

0.05 g瓜爾膠被濃硫酸水解后中和定容至100 mL,取 lmL測(cè)定還原糖量。通過計(jì)算測(cè)得瓜爾膠總糖含董為 77.1%。

2.4酶解試驗(yàn)結(jié)果與分析

通過單因素試驗(yàn)，分別獲得各因素的最佳試驗(yàn)結(jié)果，即 加酶M20 IU/g、瓜爾膠濃度0.5%、酶解溫度456、

時(shí)間8 h?？紤]到高濃度的瓜爾膠因?yàn)轲ざ冗^大而不利于酶 解反應(yīng)的進(jìn)行，故在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定瓜爾膠溶液。

濃度為03%，選擇加酶量、酶解溫度、酶解pH和時(shí)間4因 素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以確定酶解瓜爾膠制備半乳甘露低 聚糖的最佳條件。正交試驗(yàn)因素及水平見表2,正交試驗(yàn)結(jié) 果見表3„根據(jù)正交結(jié)果分析，PH對(duì)酶解率的影響最大，其 次是加酶M,反應(yīng)時(shí)間和溫度對(duì)酶解率率的影響相對(duì)較小。 酶法制備瓜爾膠半乳甘露低聚糖的研究，酶解的最佳條件為A2B3C2D2，即瓜爾膠濃度0.5%,加酶量 20 IU/g，pH 6.0,50 "C,反應(yīng)時(shí)間8 h。由于此條件在正交 表中并未列人，故按此條件進(jìn)行驗(yàn)證[14],測(cè)得其酶解率為 24. 2% ,平均聚合度為4.13,優(yōu)于正交表中的試驗(yàn)值。