瓜爾膠是一年生草本顯科作物瓜爾豆 rc^ono/o6i«)種子中的胚乳多糖[1]。p-甘露聚糖酶能將瓜爾 膠、魔芋膠等可食性植物膠分解為低聚糖[2]，此外,P-甘露聚 糖酶在醫(yī)藥和石油開采等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。甘露聚糖 酶存在于各種生物體中，比如細(xì)菌、絲狀真菌和動(dòng)植物中[3]。 微生物來源的P-甘露聚糖酶有活性好、來源穩(wěn)定、作用溫度 和pH范圍廣、容易提取等優(yōu)點(diǎn)[4]。因此微生物來源的p-甘 露聚糖酶已成為國(guó)內(nèi)外研究的重要方向。該研究首次從亞 麻液中篩選到1株降解瓜爾膠的產(chǎn)甘露聚糖酶的金黃桿 菌HL-28,通過紫外誘變育種提高了菌株產(chǎn)甘露聚糖酶的能 力，為P-甘露聚糖酶在食品、醫(yī)藥和石油工業(yè)中的廣泛應(yīng)用 奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法 1.1材料

1.1.1亞麻樣品。亞麻原莖由黑龍江省巴彥亞麻有限公司 提供。

1.1.2 主要培養(yǎng)基。富集培養(yǎng)基（g/L):瓜爾膠3.0、 KH2P04 0.5，PH 7.0;分離培養(yǎng)基(#L):瓜爾膠 3.0、KH2P04

1.0、MgSO4 • 7H20 1.0、]\札(：15.0、瓊脂18.0、?117.0;初篩 培養(yǎng)基（g/L):瓜爾膠 3. 0、CaCl2 0_ 5、KH2P04 0_ 05、NaCl 0• 8、MgS04 • 7H2 0 0.025、KN03 0.7、酵母膏2.0、蛋白胨5.0、 瓊月旨18.0、PH7.0;種子培養(yǎng)基(g/L):胰化蛋白胨10.0、酵母 提取物5_ 0、NaCl 10. 0、pH 7. 0;產(chǎn)酶培養(yǎng)基（g/L):瓜爾膠

3.0、CaCl2 0. 5、KH2P04 0.05、NaCl 0. 8、MgS04 • 7H20 0• 025、 KN03 0• 7、酵母膏 2.0、蛋白胨 5.0、PH 7.0。

1.2方法

1.2.1菌種的初篩。將亞麻原莖放入裝水的燒杯中37 t

1.2.2粗酶液的制備。取種子液接種于發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基 中，發(fā)酵液經(jīng)離心后上清液即為粗酶液。

1.2.3甘露聚糖酶活性的測(cè)定。采用改進(jìn)的3,5-二硝基水 楊酸法(DNS方法）測(cè)定酶活力[5];利用比色法測(cè)定酶解后 還原產(chǎn)物的生成量，以表示酶的活力。酶活力定義:在一定 溫度和pH下，以每分鐘生成相當(dāng)于1 pmol D-甘露糖所需酶 量為一個(gè)酶活力單位(IU)。

1.2.4菌株的鑒定。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[6]和東秀珠 等[7]方法對(duì)其進(jìn)行形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化測(cè)定等方 面的初步鑒定。

菌株采用CTAB法提取細(xì)菌總基因組DNA，利用通用引 物 27F: 5 '-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和 1492R: 5 '-TACG- GYTACCTTGTTACGACTT-3'進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件： 94 t預(yù)變性3 min;94 T變性30 s,56丈退火30s，72丈延伸 1.5 min，共30個(gè)循環(huán);72 T延伸10 min。PCR產(chǎn)物回收純 化后與載體PMD18-T連接,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109,經(jīng) 質(zhì)粒PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的菌液交于上海生工生物工程有限公 司測(cè)序。

1.2. S紫外誘變。挑取出發(fā)菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中， 37 t培養(yǎng)約13 h。常溫離心后用生理鹽水洗滌菌體,調(diào)整菌 懸液中菌體濃度為l〇8cfu/ml。將制備好的菌懸液在紫外燈 下照射〇、1〇、15、2〇、25、30、35、40、45、5〇8,涂布于1^固體平 板培養(yǎng)基上,37丈倒置培養(yǎng)過夜，計(jì)算致死率。致死率= (對(duì)照菌液的活菌數(shù)-處理菌液的活菌數(shù))/對(duì)照菌液的活菌 數(shù)。誘變后的菌株連續(xù)傳代7次測(cè)酶活檢驗(yàn)遺傳穩(wěn)定性。 1.2.6粗酶的酶學(xué)性質(zhì)。

1.2.6.1pH值對(duì)酶活力的影響。以PH 2. 2 ~ 8.0的 N^HPO。一檸檬酸緩沖溶液配制瓜爾膠溶液，在45 t下反應(yīng) 30 min測(cè)定酶活,以最高酶活為100% ,測(cè)量取3組平行，確 定酶反應(yīng)最適pH值。

1.2.6.2pH值對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。將等量的酶液分別與 等體積不同緩沖液混合，于45 SC保溫1 h后取樣，測(cè)量其酶 活力。設(shè)定原酶液為對(duì)照組，其酶活力記為100%。計(jì)算各 pH條件下的相對(duì)酶活。測(cè)量取3組平行。

1.2.6.3溫度對(duì)酶活力的影響。分別在30、40、45、50、55、 60、65和70尤下，在最適PH條件下測(cè)定酶活,以最高酶活為 100% ,測(cè)量取3組平行，確定最適反應(yīng)溫度。

1.2.6.4溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響。將酶液分別于0、4、16、 28、37、40、55、65、75、85 下保溫1 h后取樣,測(cè)定酶活力。 設(shè)定原酶液對(duì)照組，其酶活力記為100%。計(jì)算各溫度梯度 下的相對(duì)酶活。測(cè)量取3組平行。

2結(jié)果與分析

2.1菌株的篩選與鑒定該研究從亞麻液中分離并篩選到 降解瓜爾膠的產(chǎn)P-甘露聚糖酶的細(xì)菌HL-28,初篩水解圈直 徑tf/C為5. 6,復(fù)篩采用DNS方法測(cè)定酶活力為64. 532 U/ml。該菌株的菌落呈圓形金黃色，邊緣整齊，表面光滑不 透明，革蘭氏染色陰性。該菌株的生理生化特性見表1。

表1菌株HL-28生理生化特性

特征菌株HL-28特征菌株HL-28

需氧產(chǎn)酸：海藻糖+

葡萄糖+木糖+

阿拉伯糖+七葉靈水解+

纖維二糖+吲哚產(chǎn)生-

乳糖+還原硝酸鹽+

甘露醇+淀粉水解+

麥芽糖4-產(chǎn)生色素黃色到橙色

棉籽糖+37^0生長(zhǎng)+

水楊苷—從海洋環(huán)境分得—

蔗糖

鼠李糖+從土或淡水里分得+

以菌株HL-28基因組DNA為模板擴(kuò)增16S rDNA序列， 獲得目的片段1 474 bp。該序列測(cè)序后提交至GenBank,獲 得序列登錄號(hào)KC979153。BLAST同源性比對(duì)結(jié)果顯示，菌 株 HL-28 與C/wyseoftacferiiim(登錄號(hào)為

AF531766)16S rDM序列同源性為99%。將菌株HL-28的 16S rDNA序列經(jīng)BLAST比對(duì)后選取相似度較高的序列，利 用MEGA 4.0通過鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。由 圖1可看出，所篩選菌株與金黃桿菌親緣關(guān)系最近。所以， 結(jié)合生理生化特性和16S rDNA序列分析結(jié)果，菌株HL-28 鑒定為 Flavobacteriaceae(黃桿菌科)C/tryseo6orterijim(金黃桿 菌屬）。_ 

 

圖1菌株HL-28以16SrDNA為基礎(chǔ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹 

2.2紫外誘變育種以HL-28為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變, 誘變后的致死率結(jié)果如圖2,根據(jù)誘變劑量選擇原則，紫外誘 變致死率在70% ~80%時(shí)，正突變率最高。

初篩時(shí)選擇比值大的菌株,///C比值大說明菌株 降解底物能力強(qiáng);菌落直徑大說明菌落適宜在該環(huán)境中生 長(zhǎng)。初篩染色后選擇20株正突變菌株進(jìn)行復(fù)篩，最終得到 酶活最高的突變菌株為HL-28-30,酶活力為339. 787 U/ml, 是出發(fā)菌株酶活力（64. 532 U/ml)的5. 27倍，提高了 426.54% ,表明紫外誘變效果較好。HL-28-30的1 ~7代遺 傳穩(wěn)定性研究結(jié)果（圖3)表明，該菌株遺傳穩(wěn)定性良好，可 用于后續(xù)研究。

2.3粗酶的酶學(xué)性質(zhì)

HI pH值細(xì)|活力及織定性的影響。圖4表明，當(dāng)PH值在 2.7~5.6范圍內(nèi)時(shí),酶活逐漸±升,PH值大于5.6時(shí)酶活逐漸下 降,可見酶促反應(yīng)的最適pH值為5.6,過酸過堿均導(dǎo)致其酶活力降 低。此外，甘露聚麵在PW.8 ~6.3范圍內(nèi)鍛賴定(圖5)，扯 述pH范圍內(nèi)仍保持80%的酶活。

2.3.2溫度對(duì)酶活力及其穩(wěn)定性的影響。由圖6可看出， 酶最適反應(yīng)溫度為50當(dāng)溫度在30~50 t范圍內(nèi)，菌體

產(chǎn)酶的酶活隨著溫度的增長(zhǎng)而緩慢上升，當(dāng)溫度大于50 T時(shí)酶活力急劇下降，分析原因可能是因?yàn)楦邷貙?dǎo)致蛋白質(zhì)變 性，從而使得酶活力大大減小。對(duì)于菌株產(chǎn)生甘露聚糖酶穩(wěn) 定性的研究結(jié)果見圖7。圖7表明，該菌株在溫度低于55 T 的條件下溫浴1 h能穩(wěn)定產(chǎn)生p-甘露聚糖酶D 3結(jié)論與討論

來自于細(xì)菌的甘露聚糖酶已被分離得到，比如 圖7溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的彩響

KU-1、Sp/wVigomo/i〇5strain 等[8_9]。該研究首次報(bào)道 了細(xì)菌金黃桿菌HL-28對(duì)瓜爾膠較強(qiáng)的降解能力，并且胞外 分泌甘露聚糖酶，產(chǎn)生的甘露聚糖酶活性可達(dá)64.532 U/ml， 酶活明顯高于趙意平[1°]等(34. 38 U/ml和21. 95 U/ml)、蒙 海林["]等(15.66 U/ml)所測(cè)得的甘露聚糖酶活力。李劍 芳、蒙海林和羅強(qiáng)等采用物理誘變方法提高了 P-甘露聚糖酶 活性1n-15]。該研究通過紫外誘變得到1株高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)甘露 聚糖酶的突變株HL-28-30,其產(chǎn)p-甘露聚糖酶酶活提高到 339.787 U/ml,是出發(fā)菌株酶活力的5. 27倍。不同來源的 P-甘露聚糖酶性質(zhì)差異很大，細(xì)菌中芽孢桿菌來源的甘露 聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為50 ~70 T ,最適反應(yīng)PH值為5.5 ~7.0,耐熱性較強(qiáng)。該研究中金黃桿菌產(chǎn)P-甘露聚糖酶發(fā) 揮催化作用的最適pH為5.6，最適反應(yīng)溫度50 t,與來源于 芽孢桿菌的甘露聚糖酶性質(zhì)相似。今后除了需要進(jìn)一步 篩選活力更高、穩(wěn)定性更好的菌種之外，還應(yīng)結(jié)合基因工程 的方法構(gòu)建新型高效表達(dá)的工程菌，以提高P-甘露聚糖酶的 活力和產(chǎn)量，使其達(dá)到實(shí)際應(yīng)用的目的。

吸煙與健康是一個(gè)全社會(huì)普遍關(guān)注的問題，作為研究人 員，應(yīng)從保護(hù)消費(fèi)者身體健康的角度出發(fā)，開展減害降焦的 研究，弄清焦油的產(chǎn)生機(jī)制，并依據(jù)其機(jī)制制定出改善措施 以及研發(fā)更加先進(jìn)的卷煙工業(yè)工藝，盡力在減少有害物質(zhì)的 同時(shí)滿足吸食者的吃味需求。

但隨著減害降焦研究的進(jìn)展，社會(huì)各界開始對(duì)“降焦減 害”提出質(zhì)疑:低焦油是否意味著低危害？煙民實(shí)際吸人焦 油量是否與盒標(biāo)焦油量正相關(guān)？焦油量的降低是否意味著 對(duì)人類的危害減少？客觀來講,把添加物放在煙絲中燃燒， 是否會(huì)產(chǎn)生新的有害物質(zhì)，是否真的能起到減害的作用還值 得研究。作為研究人員，不能因?yàn)橘|(zhì)疑而停止前進(jìn)的步伐， 應(yīng)該扎實(shí)推進(jìn)各項(xiàng)研究工作，用詳盡的數(shù)據(jù)進(jìn)行科學(xué)論證， 為煙草減害降焦做出長(zhǎng)足的貢獻(xiàn)。