結腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，現已成為全球癌癥死亡的第二 大主因。西方發(fā)達國家和發(fā)展中國家結腸癌的發(fā)病率和死亡率都呈上升趨勢 [1-2]，因此及時發(fā)現并對癥治療，延長病人生存期并有效控制結腸癌的發(fā)展具 有重要意義。臨床上主要的治療手段有手術、放/化療及生物療法。對于化療 藥物而言，5-氟尿°密咬（5-fluorouradl, 5-FU)仍為目前最主要和最廣泛應用 的藥物。由于普通口服制劑的吸收不規(guī)則，對胃腸刺激嚴重，5-FU的臨床給 藥形式以靜脈注射為主[u]。靜脈注射會產生較強的全身毒副作用，且病人的 順應性差，影響治療效果。因此將5-FU制成經口給藥后避免在胃、十二指腸、 空腸和回腸前端釋藥，完整運送到回盲部后釋放至結腸的給藥體系，即口服 結腸定位釋藥系統（oral colon-specific drug delivery system, OCDDS ) [4-5]用于 結腸癌的化療具有現實的臨床實用價值。該系統可以直接將藥物釋放至結腸， 避免了藥物在上消化道不必要的釋放和吸收，達到提高結腸病灶部位藥物濃 度，降低藥物用量，減少全身吸收，減低藥物潛在毒、副作用的目的，最終 提高了臨床治療效果。

吲咮美辛（Indomethacin, IDM)系非甾體類抗炎藥（NSAIDs),臨床上 用于風濕性疾病及多種關節(jié)炎的治療。近年來大量的流行病學資料和實驗研 究已證明IDM等NSAIDs可通過抑制環(huán)氧化酶-2 (C0X-2)等多種途徑抑制 細胞增殖、誘導細胞凋亡，在一定程度上起到預防和治療結腸癌的作用【6—9]。 然而NSAIDs對胃腸道的刺激和毒性反庭嚴重，限制了它們在結腸癌化學預 防中的長期應用。因此將NSAIDs制成OCDDS，乾向于結腸局部釋藥，可以 避免藥物對上消化道的刺激，提高病灶部位的藥物濃度，降低藥物的全身毒 性，最終改善藥物對結腸癌的防治效果。

目前制備OCDDS的方法有多種，但不外乎采用藥劑學 (formulation-specifc)和化學（drug-specific)兩種方法。根據釋藥機制可將 OCDDS分為以下三種主要類型：pH敏感型釋藥系統、時間依賴型釋藥系統 和酶促發(fā)型釋藥系統[1(M4]。

pH敏感型OCDDS:這類釋藥系統類似于經典的腸溶包衣制劑。即利用 整個胃腸道中小腸末端的pH值最高的特點[15-16],應用在特殊pH條件下溶解 或溶脹、容蝕的聚合物作為包衣材料，將藥物制劑包衣，避免藥物在上消化 道釋放，達到將藥物運送到小腸末端開始釋放的目的。由于腸溶包衣材料性 能成熟、方便易得以及制備工藝簡單，pH敏感型成為OCDDS中最簡便易得 的一種類型。目前已上市的口服結腸制劑大多為這種類型，如治療潰瘍性腸 炎的Asacol®和Salofalc® ( 5-氨基水楊酸)；治療克羅恩氏病的Budenofalk® 和Entocort® (布地奈德）。然而令人遺憾的是，由于小腸后端即回腸處的pH 值即在7-8,近端結腸由于大量的食物殘法被消化為短鏈脂肪酸，pH值回 落到6.5左右[11’15]，而通常使用的丙烯酸樹脂的溶解值為pH 6 (Eudrgit®L) 和pH7(Eudrgit®S/Eudrgit®FS30D),這將導致藥物的提前釋放。另外個體 間/個體內pH值的差異性以及病理狀態(tài)下pH值的變化也使得單純采用pH敏 感包衣實現藥物的結腸遞送變得不可靠。

時間依賴型OCDDS:根據口服制劑到達結腸所需要的時間，用適當的方 法延遲制劑的釋藥時間，即口服后約經5-6h開始釋藥，可達到定位于結腸釋 藥的目的，與pH敏感型不同，時間依賴型OCDDS不能通過單層包衣達到目 的，一般需采用情性/腸溶包衣與形成凝膠膨脹層或滲透泵等兩種或多種原理 相結合的工藝方法才能實現延遲5-6h釋藥的目的[17_19]，制備工藝相對復雜， 影響釋藥部位的因素較多。

酶促發(fā)型OCDDS (生物降解型OCDDS):盲、結腸內存在多種胃和小 腸中不存在、由微菌群產生的酶，如偶氮降解酶、糖苷酶、葡萄苷酸酶、果 肢酶、葡聚糖酶等等[5’2()]，它們能專一地降解相應的物質，可作為理想的結腸 靶向釋藥機制。利用可被酶降解的物質，將藥物制成前體藥物或骨架/包衣制 劑，到達結腸后經酶解作用而釋藥的OCDDS稱為酶促發(fā)型OCDDS。與胃腸 道的pH值及轉運時間不同，結腸內存在的大量菌群具有位點特異性，是一 獨立的釋藥促發(fā)機制，因此酶促發(fā)釋藥目前被認為是OCDDS中最可靠的一 種釋藥機制〇22]。常用的可生物降解材料中除偶氮聚合物外均為天然多糖類 物質，如脫乙酰殼聚糖、果肢、瓜爾膠、葡聚糖、菊粉、硫酸軟骨素、環(huán)糊 精等[2347]。這類材料除了具有生物可降解性、生物相容性、溶脹性和可成膜 性的特點之外，它們來源豐富、價廉、安全無毒，被公認為是實現結腸靶向 最具實用價值的材料。然而多糖類物質的高親水性，對藥物的保護能力有限， 易造成藥物的提前釋放，并且多糖類物質遇水形成高粘度的溶液，限制了劑 型制備的種類，到目前為止國內外大多數研究停留在骨架片和壓制包芯片的 制備123^29]。骨架片通過擴散/溶蝕機制釋藥，因此在胃和小腸內即有大量 的藥物釋出，無法實現有效的釋藥時滯。壓制包芯片在包衣過程中使用較大 壓力，形成非常緊密的包衣層，雖然可保護藥物安全通過胃和小腸，但是進 入結腸后多糖衣層的水化速度慢，酶不易進入衣層發(fā)揮降解作用，最終導致 酶促發(fā)藥物釋放機制的靈敏度下降，藥物在結腸內釋放緩慢，且藥物可能釋 放不冗全。

因此，要實現有效的結腸定位釋藥通常不能依靠一種釋藥機制，往往需 幾種機制共同作用，才能克服消化道的生理屏障，實現藥物的結腸遞送與釋

放。

瓜爾股（guar gum, GG )是從廣泛種植于印巴次大陸的豆科植物瓜

爾豆中提取得到的一種植物膠。其主要成分為半乳甘露聚糖，就其分子結構 來說是一種非離子多糖，主鏈由(l-4)-yS-D-甘露糖為單元連接而成，側鏈由 單個a-D-半乳糖組成并以(1-6)鍵與主鏈相接，甘露糖/半乳糖的比例為2:1 [2?21](結構見圖1)。瓜爾肢遇水溶脹并形成粘性的膠體溶液，除了廣泛用 做食品增稠劑外，可以作為粘合劑和阻滯劑用于制劑的研制。由于瓜爾膠的 膠凝作用可以阻滯藥物自制劑中的釋放，同時它可被盲/結腸中的細菌產生的 酶降解[3M1]，因此成為近年來OCDDS中研究較多的可生物降解材料之一 [29,32-34】。由于瓜爾膠遇水形成高粘度的股體溶液，使其在酶促型OCDDS中 的應用目前僅限于骨架片和壓制包芯片的研究[23’29,33’35_38]。而小丸具有胃腸道 分散均勻，與腸粘膜接觸面積大、轉運時間受胃腸道生理狀態(tài)影響小等優(yōu)點， 被認為是目前口服結腸定位釋藥系統的最佳劑型[3941]。

因此本文以小丸為劑型，瓜爾膠為可生物降解的材料，5-氟尿嘧啶和吲 咮美辛為模型藥，立足于最具結腸靶向特異性的酶促發(fā)釋藥機制，結合pH 敏感/時間依賴釋藥機制，通過流化床包衣技術分別研制了 pH敏感-酶促皮雙 重控制OCDDS和時間依賴-酶促發(fā)雙重控制OCDDS,考察它們的體內、外 釋藥行為，評價其結腸靶向性，以獲得制備結腸靶向給藥系統的可靠技術， 為臨床治療/預防結腸癌提供療效確切、毒副作用低的5-氟尿嘧咬和吲咮美辛 的新劑型。并且，5-氟尿'癌咬和吲咮美辛作為水溶性藥物和難溶性藥物的代 表為其他藥物的口服結腸定位釋藥系統的研究提供了指導和借鑒。

受胃腸道生理特點及材料固有特性的制約，依靠單一機制釋藥的OCDDS 往往在體內的結腸靶向有效性和重復性不佳[“5]。本章采用pH-酶雙重促發(fā)機 制設計口服結腸定位釋藥小丸，原理如圖1.1所示。分別以Eudragit FS30D 和瓜爾肢為外層pH敏感衣及內層酶敏感衣對載藥丸芯進行雙重包衣。外衣 膜Eudragit FS30D保護藥物通過胃、十二指腸和空腸，到達回腸后在pH值 為7?8的腸液中溶解（EudragitFS30D的溶解閾值為pl^7),內層瓜爾膠暴 露于腸液中。瓜爾膠在水溶性的環(huán)境中不斷地吸水、溶脹，逐步在小丸表面 形成稠厚的凝膠層，這層凝膠層既減緩水分繼續(xù)向內滲入同時也阻礙藥物向 外滲出，因此可以在Eudragit FS30D溶解后繼續(xù)保護藥物不釋放。當包被瓜 爾膠凝股層的小丸進入結腸后，結腸內微菌群產生的酶擴散進入凝膠層發(fā)揮 酶解作用，瓜爾肢被水解為短鏈寡糖，凝肢層逐漸松散并消失，位于丸芯的 藥物層可以以更快的速度釋出。

Pellet remains €nteric coatGuar gumDrug diffusion• Guar gum is degraded and drug

intact 1 dissolvesswellsbegins1 releases

1

proximaldistal (pH7.0?7.5)ilecH^ecal junction

stomach small intestinej colon

Fig. 1.1 Schematics of the conceptual design of the pH-and enzyme-controlled colon-specific delivery

system (not to scale).

 

1.材料與儀器

1.材料

5_氟尿嘧啶(批號〇2〇%1)

聚乙烯吡咯烷酮（PVPK30)

聚乙二醇（PEG4000)

羥丙曱纖維素（HPMC, 5cPa-s)

蔗糖丸芯（PF101, 710-850(im) 瓜爾膠

(規(guī)格分別為 900 ~ 1300cps、2600 5500cps)

腸溶型丙烯酸樹脂水分散體 (Eudragit FS30D)

檸檬酸三乙酯（TEC)

半乳甘露糖苷酶(0.2U/mg)

5-溴尿嘧啶（5-BU,內標）

甲醇（色譜純）

用于HPLC的試劑為色譜純，鹽酸、

分析純

2.儀器

JGM-H50氣流粉碎機

UV-2401PC型紫外分光光度計

BS210S電子天平

BS610S電子天平

85-2型恒溫磁力攪拌器

微型流化包衣設備

GPCG1.1型流化包衣機

藍森牌離心式單相交流鼓風機

DDB-320多功能電子蠕動泵

ZRS-8G智能溶出儀

S-520掃描電子顯微鏡

Agilent 1100 Series高效液相色譜儀

南通制藥總廠

國際特品（香港）有限公司 上?；瘜W試劑采購供應站 上海Colorcon包衣技術有限公司 法國NP Pharm公司 法國Rhodia公司

~ 3100cps、4000 ~ 4500cps 和 5200 ?

德國degussa R6hm公司

美國Morflexs公司 Fluka Biochemika Sigma公司 Merck公司

磷酸二氫鉀、氫氧化鈉等其他試劑均為

華東理工大學 曰本島津 Sartorius Sartorius

上海智威電器有限公司 自制

德國Glatt公司 浙江溫嶺市潘郎鼓成機廠 寧波石浦海天電子儀器廠 天津大學無線電廠 曰本Hitachi公司 美國安杰倫公司 

(G1322ADEGASSER, G1311A QuatPump, G1313A ALS, G1315B DAD )

XW-80型旋渦混合器上海超聲波儀器廠

3.動物

Wistar大鼠，250±20g，清潔級復旦大學醫(yī)學院實驗動物科學部 Beagle犬，3，8.0±2.0 kg,普通級上海市新岡實驗動物場

2.實驗方法

1.體外分析方法的建立

1.15-FU小丸含量測定方法的確定

1.1,1小丸含藥量測定波長的確定

參照中國藥典，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液配制一定濃度()的5-FU 溶液，于200 ~400nm范圍內進行紫外掃描，確定檢測波長。

1.1.2標準曲線的制備

精密稱取5-FU100 mg，用pH7.4PBS溶解定容于100 ml量瓶。分別精密 吸取一定體積的溶液，作不同倍數的稀釋，所得濃度分別為3、6、9、12、 15、18pg/ml，于所確定的波長處測定吸收度，以吸收度（A)對來度（C, pg/ml) 作線性回歸，得標準曲線方程'。

1.1.3輔料干擾試驗

稱取處方量輔料于1〇〇1111量瓶中，加入0117.4?88適量，超聲1〇111丨11后 定容。離心(3500rpm, 15min)、過濾，續(xù)濾液經50倍稀釋后于200~400nm

波長范圍內進行紫外掃描。

1.1.4回收率試驗

精密稱取40、50、60 mg 5-FU置于100ml量瓶中，再稱取相當于一個劑 量的輔料加入到上述量瓶中，加PH7.4PBS適量，超聲后定容。離心(3500rpm， 15min)、過濾，續(xù)濾液50倍稀釋后于265nm處測定吸收值。以測得的量和 加入的量比較，計算回收率。

1.1.5 5-氟尿嘧啶吸收度穩(wěn)定性試驗（室溫）

精密稱取5-FU100 mg,用pH7.4PBS溶解并轉移至100 ml量瓶中并定容 至刻度。分別吸取一定體積的溶液，作不同倍數的稀釋，所得濃度分別為3、 9、15pg/ml,室溫放置，分別于第Oh、6h、12h和24h在波長265nm處測 定吸收度。

1.1.6小丸含藥量的測定

精密稱取相當于含5-FU 50mg的小丸，在研缽中加適量的pH7.4PBS充 分研磨至完全溶解，轉移至100ml量瓶中，加pH7.4PBS適量，超聲10 min 后定容。離心(3500rpm, 15min)、過濾，續(xù)濾液用pH7.4PBS 50倍稀釋，于 265nm處測定吸收度，代入標準曲線計算藥物的濃度。

1.25-FU小丸體外釋放度測定方法的確定

本文分別以 O.lmol/LHCl、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS 作為模擬

胃、小腸中前段（十二直腸和空腸）、小腸后段（回腸）及結腸pH環(huán)境的釋 放介質；含有半乳甘露聚糖酶（0.00968U/ml)的pH6.5PBS作為模擬在體結 腸酶環(huán)境的釋放介質。因此考察37°C下5-FU在不同介質中的穩(wěn)定性及酶和 其它輔料對測定的影響，分別建立4種釋放介質中5-FU測定的標準曲線并考 察其回收率。

1.2.1四種釋放介質中檢測波長的確定

分別用 0.1M HC1、pH6.8、pH7.4 和 pH6.5 PBS 配制一定濃度（l〇ng/ml) 的5-FU溶液，于200 ~ 400nm范圍內進行紫外掃描。

1.2.2釋藥標準曲線的制備

精密稱取5-FU100mg，用上述介質溶解、轉移至100ml量瓶中并定容至 刻度。精密吸取一定體積的溶液，稀釋至3、6、9、12、15、18ng/ml，于所 確定的波長處測定吸收度，以吸收度（A)對濃度（C, pg/ml)作線性回歸， 得標準曲線方程。

1.2.35-FU在四種釋放介質中的穩(wěn)定性考察（37°C )

方法同釋藥標準曲線的制備，在37°C水浴中分別于第0h、6h、12h、 20 h和24 h在波長265nm處測定吸收度。

1.2.4釋放介質中的輔料干擾試驗

稱取處方量空白包衣小丸，裝于轉籃中，分別置于900ml恒溫37±0.5°C 的4種釋放介質中，轉速為75rpm, 20 h后取樣，樣品經0.8 jim微孔濾膜過 濾后，在200?400nm范圍對釋放液進行紫外掃描。

1.2.5釋藥回收率試驗

精密稱取5-FU 50 mg置于100ml量瓶中，再稱取相當于一個劑量的輔料 加入到上述量瓶中，分別加入0.1MHC1、pH6.8、pH7.4和pH6.5PBS，超聲 lOmin后定容。分別稀釋至3、9、15ng/ml，于265nm處測定吸收值。以測 得的量和加入的量比較，計算回收率。

1.2.6半乳甘露糖苷酶（galactomannanase)對釋放度測定的干擾試驗

半乳甘露糖苷酶為瓜爾膠的水解酶，稱取適量，用pH6.5 PBS配置成 0.0388 U/ml的酶溶液，在200 ~ 400nm范圍內進行紫外掃描。

1.3腸內容物法模擬在體結腸環(huán)境體外釋放度試驗中5-FU測定方法一HPLC 法的確定

1.3.1色譜條件

色譜柱：DiamonsilTM-C18(4.6mmx250mm，5(im)

流動相：曱醇:7K=5:95 流速： 1.0 ml/min 檢測波長：265 nm 柱溫：30°C 進樣量：20卩1

1.3.2樣品處理方法

樣品離心后（lOOOOrpm, lOmin)，上清經0.45(im的微孔濾膜過濾，續(xù) 濾液用純水稀釋10倍后，20W進樣分析。

1.3.3標準曲線的制備

精密稱取5-FU100 mg,用含4%大鼠盲腸內容物(新鮮制備)的pH6.8PBS (10000 rpm, 10 min離心后）溶解、轉移至50ml量瓶中并定容至刻度，作 為儲備液。精密吸取一定體積的儲備液，不同倍數稀釋后，來度（C)分別 為 0.5、1、10、50、100、200、300pg/ml。按樣品處理方法操作，HPLC 法 測定，以藥物峰面積（A)對濃度（C，pg/ml)作線性回歸，得標準曲線方 程。

1.3.4回收率與精密度測定

精密吸取一定體積的儲備液，稀釋不同的倍數到濃度（C )分別為1、50、 200)tig/ml，按樣品處理方法操作，以測得濃度對實際濃度之比計算回收率。

精密吸取一定體積的儲備液，稀釋不同的倍數到濃度（C)分別為1、50、

200pg/ml,按樣品處理方法操作，并作色譜分析。一天內重復五次，統計測 定數據的相對標準偏差RSD，即為方法的天內精密度。連續(xù)五天重復操作， 統計測得數據的RSD，即為方法的天間精密度。

1.3.5檢測限

用已知濃度的樣品測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，按信噪比 S/N=3時相應濃度確定檢測限。

2.載藥小丸的制備 2.1藥物的微粉化

采用水混懸液噴霧上藥，為防止混懸液中的固體顆粒堵塞噴嘴，一般要 求固體顆粒的粒徑<10^m,本研究用氣流粉碎機對藥物進行微粉化，顯微鏡 下觀察藥物的粒徑范圍為2~ 10啤。

2.2用流化床制備載藥丸芯

用微型流化床預試空白丸芯混懸上藥的處方和工藝后，用GPCG1.1型 Glatt流化床制備載藥丸芯。將粘合劑PVP溶于水中（6%, W/V)，攪拌下將 微粉化的藥物分散于其中制成混懸液，即可用于噴液上藥。上藥過程中需要 連續(xù)攬拌藥物混懸液。載藥丸芯的制備工藝如下：

微型流化床：空白丸芯10g,噴嘴直徑0.5_，控制出口溫度25-28°C, 噴液速率l.Oml/min,在固定的風量和霧化壓力下進行噴液上藥。

Glatt流化床：空白丸芯lOOOg，底噴法，噴嘴直徑1mm，進風溫度50°C, 物料溫度35°C,流化風量97-103m3/h,噴霧壓力1.5bar,噴液速率ll-13g/min。 上藥結束后，繼續(xù)流化干燥5min,接著包一層HPMC隔離衣，增重約為2% (W/W),以防止小丸在貯存過程中粘結，最終制得小丸約1495g。用篩析法 通過稱重測定小丸的粒徑分布，篩取18-24目的小丸用于包衣。

3.EudragitFS30D/瓜爾膠雙重包衣小丸的制備、釋藥影響因素及體外評價

3.1瓜爾膠包衣小丸的制備及影響其釋藥的因素 3.1.1包衣液的配制

稱取一定量的瓜爾膠，用適量的乙醇分散，攪拌下加入適量蒸餾水，最 終的包衣液為4%的瓜爾膠（W/V)在醇/水（1/4, V/V)體系中的混懸液。

3.1.2小丸包衣

將制備好的載藥小丸10 g加到自制微型流化床中，噴嘴直徑為0.8 mm, 控制出口溫度為28±2°C，噴液速率為1.2ml/min,在固定的風量和霧化壓力 下進行噴液包衣，直至達到預設的包衣增重（coat weight gain, CWG )。包衣 增重（％)=(包衣后丸重-包衣前丸重）/包衣前丸重xi〇〇%。包衣過程中需 要連續(xù)攪拌包衣液。小丸包衣完成后，將小丸置于60°C的烘箱中干燥6h。

3.1.3釋放度試驗

按中國藥典2005版規(guī)定的第一法（轉籃法）測定。稱取適量包衣小丸（含 5-FU50mg)，裝于轉籃中，置于900ml恒溫37±0.5°C的釋放介質中，轉速為 75rpm,定時取樣5ml,同時補充等量同溫的新鮮介質。樣品經0.8 pm微孔 濾膜過濾后，續(xù)濾液經適當稀釋后于265nm處測定吸收值，通過標準曲線計 算藥物的累計釋放百分率。

分別以 0.1mol/L HC1、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS 作為模擬胃、

小腸中前段（十二直腸和空腸)、小腸后段（回腸）及結腸pH環(huán)境的釋放介 質[16-2(>]。為了評價結腸內微菌群對瓜爾膠的酶解作用，在pH6.5PBS中加入 半乳甘露聚糖酶（0.00968U/ml)來模擬在體結腸環(huán)境[6-1G]。

3.1.4酶法與腸內容物法對瓜爾肢水解作用的比較

結腸內大量的菌群可以產生多種天然多糖的水解酶，其中包括半乳甘露 糖苷酶，它可以降解瓜爾膠成短鏈寡糖。通常使用兩種體系即純酶系統和腸 內容物系統來評價瓜爾膠對結腸內的微菌群的酶解敏感性。本研究分別采用 兩種體系模擬在體結腸環(huán)境，進行瓜爾肢包衣小丸的釋放度研究，并比較兩 種系統的優(yōu)、缺點。

3.1.4.1酶法[11_13]

加入不同量的半乳甘露聚糖酶至pH6.5PBS中，作為釋放介質，進行瓜 爾肢包衣小丸的釋放度試驗。釋放介質中酶的濃度分別為0.0024U/ml、 0.0097U/ml 和 0.0388U/ml。

3.1.4.2腸內容物法[6’14_16]

連續(xù)7天，每天以lml的2% (W/V )瓜爾膠水溶液對大鼠進行灌胃，誘 導大鼠盲腸內的細菌產生瓜爾肢水解酶。在釋放度試驗開始前30min，處死 大鼠，切開腹部分離盲腸，取出盲腸內容物后稱重并迅速轉移到一直通有氮 氣的PH6.8PBS中，最終形成腸內容物濃度為4% (W/V)的磷酸鹽緩沖溶液, 作為模擬結腸酶環(huán)境的釋放介質進行釋放度試驗。由于結腸內的菌群為厭氧 菌，所以在整個試驗過程中，釋放介質均保持通氮狀態(tài)。分別于預設的時間 取樣lml,并補充同等體積通氮的新鮮介廣。樣品處理按本章中試驗方法下 的1.3.2項操作，并用HPLC法進行含量分析。

3.1.5影響釋藥的因素

瓜爾肢包衣層阻滯藥物釋放的原因在于瓜爾肢遇水形成稠厚的凝膠層， 凝膠層的粘稠度及厚度與瓜爾肢粘度、包衣增重密切相關。

3.1.5.1瓜爾膠粘度的影響

分別選用粘度為 900~ 1300cps、2600~3100cps、4000~4500cps、5200 ? 5500cps的瓜爾肢對栽藥丸芯進行包衣，考察同一包衣增重下瓜爾膠的粘度對 小丸釋放度的影響。

3.1.5.2瓜爾肢包衣增重的影響

考察同一粘度的瓜爾膠不同包衣增重小丸的釋放度。

3.1.5.3釋藥介質pH的影響

考察 O.lmol/LHCl、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS 四種釋放介質對

GG包衣小丸釋放度的影響。

3.1.5_4瓜爾膠水解酶的影響

考察瓜爾膠包衣小丸在含有半乳甘露聚糖酶（0.00968U/ml)的pH6.5PBS

中的釋藥^亍為。

3.2Eudragit FS30D包衣小丸的制備及影響其釋藥的因素

制備EudragitFS30D包衣小丸，考察影響小丸釋藥的因素，確定最佳包 衣處方及工藝。在此后EudragitFS30D/瓜爾股雙重包衣小丸體內、外釋藥行 為的評價中，均以Eudragit FS30D包衣小丸為參照制劑。 3.2.1包衣液的配制

稱取一定量的Eudragit FS30D (固含物濃度為30% )，加水稀釋至固含物 的濃度為10%，作為pH敏感型包衣液。

3.2.2小丸包衣

將制備好的載藥小丸10g加到自制微型流化床中，噴嘴直後0.5mm，控 制出口溫度24±2°C，噴液速率0.8ml/min，在固定的風量和霧化壓力下進行 噴液包衣，直至達到預設的包衣增重。包衣結束包后，小丸在流化床內繼續(xù) 流化5min。

3.2.3包衣小丸的熱處理

小丸包衣完成后，將小丸置于恒溫40°C的烘箱中進行2 h的熱處理，熱 處理過程中間隔一段時間需翻動小丸，以使受熱均勻，防止粘連。

3.2.4釋放度試驗

轉籃法測定，余下操作同3.1.3項下所述。分別以O.lmol/L HC1 (2h)、 pH6.8PBS(2h)、pH7.4PBS(lh)作為模擬胃、小腸中前段（十二直腸和空腸） 及小腸后段（回腸）pH環(huán)境的釋放介盾。每次變換介廣在5min之內完成。

3.2.5影響釋藥的因素

3.2.5.1增塑劑的影響

Eudragit FS30D推薦使用的增塑劑為杵橡酸三乙酯（TEC )，用量為2-5% 或可不使用[17],因此考察不使用TEC和用量為5%時小丸的釋藥行為。

3.2.5.2包衣增重的影響

考察包衣增重分別為20%、30%和40%時小丸的釋藥行為。

3.2.5.3熱處理時間的影響

40°C分別對包衣小丸進行0、2、6、12h的熱處理后進行藥物釋放度的測 定，考察熱處理時間對小丸釋藥行為的影響。

3.3Eudragit FS30D/瓜爾膠雙重包衣小丸的制備及體外釋藥評價 3.3.1小丸的包衣

依次按本章實驗方法中3.1.2和3.2.2項下的操作對載藥丸芯進行瓜爾膠 內層包衣及FS30D外層包衣，包衣增重分別為580%和30%。

3.3.2釋放度試驗

轉籃法測定。余下操作同3.1.3項下所述。分別以pH連續(xù)變化的介質即 0.1mol/LHCl(2h)、pH6.8PBS(2h)、pH7.4PBS(lh)和 pH6.5PBS(12h)作為釋放 介質，模擬胃、小腸中前段（十二直腸和空腸）、小腸后段（回腸）及結腸的 pH環(huán)境;pH6.5PBS中加入半乳甘露聚糖酶（0.0097U/ml)來模擬在體結腸的

酶解環(huán)境。

4.小丸釋放度評價方法

比較兩條釋放曲線差異性的方法有多種，如方差分析法（ANOVA-based approaches)，非模型法（model-independent approaches)及模型依賴法 (model-dependent approaches )。其中非模型法的f2相似因子法能靈敏、準確 地反映溶出或釋放曲線之間的差異[18—19]。計算的公式如下：

>n]~°.5]

/2=501og< \ + \ln^YjVt{R,-T)2xl〇〇l

其中f2:相似因子

Rt: t時間對照制劑的累積釋藥百分率

Tt: t時間試驗制劑的累積釋藥百分率

n:釋放度試驗取樣點數

Wt:權重因子（所有數據點同等對待時Wt=1.0 )

該方程是方差總和的對數轉換形式，f2值可以靈敏地反映出兩者體外釋 放度差異。f2值在50 ~ 100之間表明兩條曲線相似。f2越大，表明體外釋放 度越接近。當f2=100時，兩者具有完全相同的釋放度；f2值<50,兩者釋放度 則存在明顯差異，隨f2減小而差異增大，當f2趨近于0時，則釋放度差異最

大。

本文均采用込相似因子法評價釋放度的差異性。

5.掃描電鏡觀察

用掃描電鍵觀察FS30D/GG雙層包衣小丸的剖面結構及GG包衣小丸釋 放前后的表面形態(tài)。觀察前樣品噴金，以使其具有導電性。

6.體內分析方法的建立

5-FU是臨床上常用的抗腫瘤藥物，對消化道癌和其他實體瘤均有良好的 療效。測定5-FU血藥濃度的方法主要為高效液相色譜法(HPLC)。本文參考 文獻報道的分析方法[2G_21]，采用下述的反相高效液相色譜法測定犬口服5-FU 制劑后的血藥濃度。

6.1色譜條件

色譜柱：DiamonsilTM-C18(4.6mm><250mm, 5|im)

流動相：甲醇：7^=5: 95 流•速：1.0 ml/min

檢測波長：265 nm 柱溫：30°C

內標：5-BU (10|ag/ml)

進樣量：20(^1

記錄5-FU與5-BU的峰面積比為響應參數，內標法定量。

6.2血漿樣品處理方法

精密吸取犬血漿50〇nl，5-BU(10|ag/ml)10〇W于lSml離心管中加入5ml乙 酸乙酯，旋渦混合lOmin，離心15min(3500rpm)，取上層有機層于5ml潔凈離 心管中，于40°C水浴中用氮氣吹干，殘渣用lOOjil流動相溶解，離心后取2〇nl

進樣分析。

6.3血藥濃度標準曲線的建立

精密吸取犬血漿5004,加入5-FU標準溶液（100^1),使?jié)舛确謩e為20, 50，100, 200, 400，600，800ng/ml，加入內標的方法同上，按血漿樣品處理 方法操作，以HPLC法測定，以樣品峰面積與內標峰面積的比值R( A5.FU/A5.BU ) 對樣品濃度（C5_FU)作線性回歸，求回歸方程。

6.4血藥濃度分析方法的評價

6.4.1方法精密度

取空白血漿500|nl數份，加入5-FU標準溶液，使?jié)舛确謩e為50、200、 600ng/ml,加入100^1內標溶液，按血漿處理方法操作并作色譜分析。一天 內重復五次，統計測定數據的相對標準偏差RSD，即為方法的天內精密度。 連續(xù)五天重復操作，統計測得數據的RSD,即為方法的天間精密度。

6.4.2方法回收率

取空白血漿500W數份，加入5-FU標準溶液，使?jié)舛确謩e為50、200、 600ng/ml，加入100^1內標溶液，每一濃度配置五份樣品，按血漿處理方法 操作并作色譜分析，以測得的濃度對實際濃度之比計算方法回收率， 6.4.3提取回收率

取空白血漿5004數份，加入5-FU標準溶液，使?jié)舛确謩e為50、200、 600ng/ml,每一濃度配置五份樣品，按血漿處理方法操作并作色譜分析，分 別與同濃度的5-FU標準溶液直接進樣的峰面積做比較，計算提取回收率。 6.4.4檢測限

用已知濃度的樣品測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，按信噪 比S/N=3時相應濃度確定檢測限。

6.4.5最低定量限

樣品中被測物能夠被定量測定的最低量，其測定結果應具有一定的準確 度和精密度（兄SD£20 % ,這20 %，測定偏差E = (C *i-CU)/C標><1〇〇 % )。

7.Eudragit FS30D/瓜爾肢雙重包衣小丸在犬體內的藥物動力學研究

口服OCDDS后進行藥物動力學研究，根據不同時間下的血藥濃度，可 計算出制劑的T^、C_和AUC,更為關鍵的是可以了解該制劑的體內吸收 時滯，以此估計吸收是否在到達結腸后開始，即通過藥物動力學試驗可以評 價制劑的結腸把向性。

7.1研究對象

Beagle 犬 5 只，8.0±2.0kg,普通級 7.2試驗制劑與參比制劑

受試制劑：FS30D/GG雙重包衣小丸：FS30D層包衣增重30%, GG層包衣 增重580%。

參比制劑：栽藥小丸

FS30D包衣小丸，包衣增重30%。

7.3試驗設計 服藥方法：

采用自身對照交叉試驗設計，洗凈期為1周。5只犬，禁食過夜（18h), 次日清晨空腹給藥(含5-FU 50mg),用10ml水灌胃。由于本章Eudragit FS30D/ 瓜爾肢雙重包衣小丸和后文第三章中瓜爾膠-乙基纖維素包衣小丸的犬體內 藥物動力學研究均以5-FU栽藥小丸為參比制劑，因此兩部分藥物動力學試驗 一起完成。服藥方案見表1.1。

血樣采集：

于服藥前后設定的時間從前肢靜脈取血1.2ml，置于肝素鈉離心管中， 8000rpm離心lOmin，取上清血漿于-20°C冷凍保存，待分析。

服用載藥小丸的取樣時間點：5min、15min、30min、45min、lh、1.5h、 2h、 3h、 4h、 5h、 7h、 9h。

服用FS30D包衣小丸的取樣時間點：lh. 2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、

10h、 12h、 24h

服用FS30D/GG雙重包衣小丸的取樣時間點：lh、2h、3h、4h、5h、6h、 7h、 8h、 10h、 12h、 24h

樣品分析方法：

用本文建立的HPLC法測定血漿中的5-FU濃度。

7.4數據處理

直接讀取(：_和Tmax，并用t檢驗法對兩參數進行方差分析（其中Cmax 經對數轉換）。

Tab 1.1 Design of administration method of subjects receiving four fonnulations.

SubjectPhase of administration

IiiHIIV

1ABcD

2BCDA

3CDAB

4DABC

5ACBD

A:uncoated pelletsB: FS30D coated pellets

C: FS30D/GG doubble coated pellets D: GG-EC mixed coated pellets 三.結果與討論 i.體外分析方法的評價 1.1 5-FU小丸含量測定分析方法的評價 1.1.1檢測波長的確立

紫外掃描圖譜（圖1.2)表明在pH7.4PBS中5-FU的最大吸收波長為 265nm,因此選擇265nm作為小丸含量測定的波長。

U.2含量測定標準曲線

在pH7.4的PBS中，5-FU在3 ~ 18pg/ml的范圍內，吸收度和濃度的線 性良好，標準曲線方程為：A=0.0482C-0.0027 (r-0.9999)

1.1.3輔料干擾試驗

圖1.3表明輔料在波長265nm處對主藥的測定無吸收干擾峰（A=0.005 )。

Fig. 1.2 The ultraviolet spectrum of excipient of pellets in pH7.4PBS. 1.1.4回收率試驗 結果見表1.2

Tab 1,2 Accuracy of 5-fluorouracil in pH7.4PBS.

Cadded (Hg/ml)CdetectedAccuracy

(%)Mean ± SDRSD (%)

88.15±0.14101.88

1010.16 士 0,14101.60100.99± 1.301.28

1211.94±0.1299.50

 

選取小丸含量測定標準曲線上高、中、低三個濃度，分別于不同的時間 測定吸收度。結果見表1.3。表明5-FU在pH7.4PBS中24h內穩(wěn)定。

Tabl .3 Absorbance of 5-fluorouracil in pH7.4PBS for 24h (n=3).

5-FUAbsorbanceMeanSD

(Hg/ml)Oh6h12 h24 h

30.1410.1440.1470.1460.1450.003

90.4320.4340.4460.4430.4390.007

150.7200.7250.7380.7370.7300.009

1.25-FU小丸體外釋放度測定方法的評價 1.2.1四種釋放介質中檢測波長的確定

由圖 1.4 可知 5-FU 在 0.1M HC1、pH6.8、pH7.4 和 pH6.5 PBS 四種釋放

介質中的紫外掃描圖譜無區(qū)別，最大吸收波長均為265nm。

1.2.2釋藥標準曲線

四種釋放介質中，5-FU吸收度和濃度的線性曲線方程分別為： 0.1MHC1A=0.0535C+0.0013 (r-0.9999) 濃度范圍：3 ~ 18pg/ml

濃度范圍：3 ~ 18|ug/ml 濃度范圍：3 ~ 18(ig/ml 濃度.范圍：3 ~ 18jxg/ml

pH6.8PBSA=0.0530C+〇.〇〇75 (t-0.9999)

pH6.5PBSA-0.0541C+0.0024 (r^l.OOOO)

pH7.4PBSA=0.0482C-0.0027 (r=0.9999)

37°C水浴下不同時間5-FU在四種釋放介質■中的吸收值見表1.4。

Tabl.4 Absorbance of 5-fluorouracil in different media at different time (n=3).

0.1MHC1

5-FUAbsorbanceMean土 SD

(Hg/ml)Oh6h12 h

30.1630.1650.1600.163±0.001

90.4850.4830.4870.485 土 0.001

150.8000.8030.8060.803土 0.000

pH6.8PBS

5-FUAbsorbanceMean 土 SD

(Hg/ml)Oh6h20 h

30.1700.1680.1670.168 士 0.002

90.4790.4780.4770.478土0.001

150.8060.8050.8020.804土 0.002

pH6.5PBS

5-FUAbsorbanceMean 土 SD

(fig/ml)Oh6h12h24 h

30.1660.1680.1690.1680.168 土 0.001

90.4870.4880.4860.4870.488土 0.001

150.8160.8130.8140.8050.812士0.005

pH7.4PBS

5-FUAbsorbanceMean 土 SD

(|ag/ml)Oh6h12h24 h

30.1410.1470.1470.1460.145 土 0.003

90.4320.4340.4360.4360.432土 0.002

150.7200.7220.7180.7230.721 士 0.002

表明5-FU在體外釋放度試驗過程中穩(wěn)定性良好，分析方法有效可行。

1.2.4釋放介質中的輔料千擾試驗

由圖1.5可知輔料在四種釋放介質中基本無千擾。

Figl .5 The ultraviolet spectra of excipient in different dissolution media(0.1M HC1, pH6.8,

pH7.4 和 pH6.5 PBS).

1.2.5釋藥回收率

四種釋放介質中的釋藥回收率見表1.5，回收率均在98 ~ 103%之間，符

合要求。

Tab 1.5 Accuracy of 5-fluorouracil in different dissolution media.

0.1MHC1

Cadded (Hg/ml)Cdetected (f^§/ml)Recovery (%)Mean 土 SDRSD (%)

33.11 土 0.10103.67

99.20 土 0.07102.22102.92± 0.730.71

1515.29±1.16102.87

pH6.8PBS

Cadded (|ig/ml)CrfetectedAccuracy (%)Meari 士 SDRSD (%)

33.06 士 0.04101.92

98.84 士 0.0998.07100.06土 1.931.93

1515.05±0.09101.19

pH6.5PBS

Cadded (l^g/ml)C detectedAccuracy (%)Mean 土 SDRSD (%)

33.13±0.17104.33

99.16±0"09101.78102.57士 1.531.48

1515_24 土 0.09101.60

 

Cadded (^g/ml)CdetectedAccuracy (%)Mean 土 SDRSD(%)

33.06 士 0.10102.00

99.12±0.14101.33100.82± 1.501,49

1514.87 士 0.1499.13

1.2.6半乳甘露糖苷酶在pH6_5 PBS中對釋放度測定的千擾試驗

由圖1.6可知該酶在波長265nm處對主藥的測定無吸收干擾峰(A=0.009 )。

Figl.6 The ultraviolet spectrum of galactomannanase in pH6.5PBS.

1.3腸內容物法模擬在體結腸環(huán)境的體外釋放度中5-FU測定方法——HPLC 方法的評價 1.3.1方法的專屬性

5-FU的HPLC圖譜見圖1.7。由圖可知在建立的色譜條件下，5-FU的保 留時間為6.8min，釋放介質對藥物的測定無干擾。

5-FU 標準曲線方程為 A=6.0423C+4.4779 (r=0.9999),濃度在 0.5~ 300|_ig/ml范圍內線性關系良好。

1.3.3回收率和精密度

5-FU在腸內容物法模擬結腸體內環(huán)境的釋放度試驗中的回收率見表1.6。 測定方法的日內和日間精密度見表1.7。結果表明，所建立的分析方法準確.

可靠。

Tabl .6 Accuracy of the determination of 5-fluarouracil in the dissolution media containing rat caecal

contents (n=5).

AddedDetcted

〇g/ml)Accuracy

(%)MeaniSD

(%)RSD

(%)

11.02土0.01102.00

5-FU5049.78土 1.0298.1699.75土 2.002.00

,200198.17 土 2.6799.09

Tab 1.7 Precision of the determination of 5-fluorouracil in rat caecal content-based dissolution test

(n=5).

Added (^ig/ml)Detcted (ng/ml)RSD (%)

t1,01 士0.032.97

With in-day5049.88土 1.252.51

200203.67士 2.561.27

10.97 士 0.022.06

Between-day5051.01 土 1.202.35

200198.37土 3.211.62

1.3.4檢冊j I1艮

檢測限為0.25|iig/ml。

2.載藥小丸的評價

制備藥物小丸的傳統方法是滾動成丸法，但該法的藥物損失大，且小丸 粒度分布不均。目前國內外常采用的方法之一是擠出-滾圓法[22_24]，但該法至 少需要擠壓機和滾圓機兩臺機器方能完成造丸過程，且操作繁瑣，投料量相 對較大。采用流化床對空白丸芯噴液上藥制備載藥小丸，只要空白丸芯粒徑

均勻，就可得到粒徑分布集中的小丸，并且上藥效率高。本研究使用粒徑范 圍在710-850叫1 (20~24目）的空白丸芯，經Glatt流化床上藥后，上藥效 率達92.40% (上藥效率（％ )=藥物的實際含量/藥物的理論含量x 1 〇〇% )，粒 徑范圍在18-24目的小丸占99.4% (圖1.8)，小丸的載藥量為28.23%。本 文第一章與第三章的研究均采用同一批載藥丸芯。

測定載藥小丸在不同介質中的溶出度，結果見圖1.9,栽藥小丸在各介質 中均能迅速溶出，5min內的溶出量均大于95%,因此載藥丸芯不會成為阻滯

釋藥的因素。

o o o o

8 6 4 2 %£S-5M

100， 93 4

<2424-2020-18>18

Size range of pellets (mesh)

Fig. 1.8 Size distribution of uncoated pellets of 5-fluorouracil. 100 -rm -—■ i：

-A—0.1MHCI pH6.5PBS —pH6.8PBS l-pH7,4PBS

0102030

Time ( min)

Fig. 1.9 Dissolution behavior of uncoated pellets of 5-fluorouracil.

3.Eudragit FS30D/瓜爾膠雙重包衣小丸的評價

3.1瓜爾膠包衣小丸的評價

3.1.1包衣液的配制及包衣小丸的制備

瓜爾膠在水中形成粘稍的膠體溶液，粘度過大和流動性不佳使得它在小 丸包衣中無法通過端動泵和空氣壓縮泵順利噴出，并且噴液后小丸表面不易 干燥易發(fā)生粘連。為了將瓜爾肢應用于小丸劑（結腸靶向的最佳劑型）的包 衣，嘗試不同的方法配制包衣液以降低漿料粘度：1、降低瓜爾肢容液的濃度 直到具有適宜粘度以適用于包衣。2、以PVP的乙醇溶液作為粘合劑將瓜爾膠 分散于其中。3、選擇適宜的瓜爾膠濃度及醇/水比例，將瓜爾膠混懸于水/醇 系統中，形成具有適當濃度及粘度的包衣液。結果表明：方法1、對于粘度為 5200~5500cps的瓜爾膠而言，其水溶液的來度要50.25%時，包衣液的粘度才 足夠小到可以進行噴霧包衣操作，但如此低的濃度將導致包衣時間過長。方 法2、瓜爾膠分散于PVP的乙醇溶液中，其包裹于載藥丸芯上的能力完全依賴 于PVP醇溶液的粘度，噴液過程中瓜爾膠易與PVP溶液分離，被干燥成粉， 不能有效地包覆于小丸表面，此法的包衣效率很低，僅有25.60%。方法3、利 用瓜爾膠不溶于乙醇，遇水則形成粘性膠體的性質，通過加入適量的乙醇， 降低包衣液的粘度。保留下來的粘性既足夠小，使包衣液可順利噴出；同時 包衣液的粘附力也足夠大，保證瓜爾膠可以較高的效率包覆于載藥丸芯。本 文最終采用方法3,配置4%的瓜爾膠（W/W)的醇/水（1/4, V/V)混懸液作 為包衣液，在自制流化床中對栽藥丸芯進行噴液包衣，包衣效率為75.81±2.13 % ( RSD=2.25%, n=3 )8

由于包衣液為瓜爾膠的混懸液而非溶液，所以噴霧包衣后形成的衣層并 非連續(xù)的衣膜，而是瓜爾膠顆粒的堆積。根據近年來國外出現的干粉包衣的 原理[2M8]，當包衣材料粒子的粒徑小于10[mi以下時，可通過加大增塑劑的用 量、升高包衣操作溫度，升高熱處理溫度及延長熱處理時間等工藝手段促進 衣膜形成。但是瓜爾膠經3次氣流粉碎后，粒徑仍然在lOO^m左右，無法通過 加劇包衣操作及熱處理條件來促成衣膜的形成。因此本文沒有考察增塑劑的 種類及用量對瓜爾膠包衣小丸釋放度的影響。包衣結束后，小丸在60°C的烘 箱干燥6 h，也僅是為了除去殘留的水分。本文最終選用粒徑盡可能?。?00 目）的瓜爾膠作為包衣材料，以使包衣后瓜爾膠可以緊密堆積在小丸表面形 成致密均勻的衣層（見圖1.19B)。

3.1.2酶法與腸內容物法對瓜爾膠水解作用的比較

為了評價以瓜爾股為載體的給藥系統的酶促發(fā)釋藥機制，本文根據文獻 報道的方法分別采用加酶（半乳甘露糖苷酶）及腸內容物的方法進行瓜爾膠 包衣小丸的釋放度考察，結果見圖1.10。結果表明，不同濃度的酶和4%的腸 內容物均可以加快藥物的釋放，酶濃度越高藥物釋放越快，當酶濃度達到 0.0097U/ml時與4%的腸內容物的酶促釋藥效果相當。因腸內容物法需要提前 誘導動物產生相關酶、腸內容物制備及釋放度試驗全程需通氮、并且樣品需 采用HPLC法分析，相比之下酶法具有操作簡便，樣品分析簡單迅速的優(yōu)勢,

故本文以后的研究中均采用酶法（(K00968U/ml，pH6.5PBS)來模擬在體結腸

一with galactomannanse(0.0024U/mI) — with 4% rat caeca! content

的酶環(huán)境。

0123456789101112

Time (h)

Fig. 1 • U) Release profiles of 5-fluorouracil from guar gum coated pellets in the absence and presence of various concentrations galactomannanase in pH6.5 phosphate buffer and in presence of 4% rat

caecal contents in pH6.8 phosphate buffer.

3.1.3影響釋藥的因素 3.1.3.1瓜爾肢粘度的影響

包被在小丸上的瓜爾膠遇水形成凝膠層，水分逐漸向丸芯滲入，經過一 定時間后到達小丸內部，潤濕載藥丸芯，藥物通過瓜爾膠凝膠層逐漸釋放到 介質中^藥物從載藥層釋放的快慢與包衣層的性質密切相關。本文分別選用 枯度為 900 ~ 1300cps、2600 ~ 3100cps、4000 ~ 4500cps 和 5200 ~ 5500cps 的 瓜爾膠對載藥小丸包衣，包衣增重均在550%左右。各種枯度的瓜爾膠包衣小 丸的釋放度結果見圖1.11。瓜爾膠對藥物釋放的阻礙作用，隨著瓜爾膠粘度 的增大而增大。以T1()(藥物釋放10%所需的時間）作為參數來評價瓜爾肢衣 層阻滯藥物釋放的能力，上述4種枯度的瓜爾膠包衣小丸的T1Q分別為5 min、 20 min、40 min和60 min。在本文以后的研究中均采用枯度為5200 ~ 5500cps 的瓜爾肢。

0123456789101112

Time (h)

Fig. 1.11 Release profiles of 5-fluorouracil from pellets coated with guar gum of different viscosity (about 550% coat weight gain) in pH6.5 phosphate buffer.

3.1.3.2瓜爾膠包衣增重的影響

隨著瓜爾膠包衣層厚度的增加，衣層阻礙藥物釋放的能力增強。從圖1.12 可以看出當包衣增重達到580%時，藥物lh的累計釋放量為9.08%, 12h的 釋藥量接近100°/〇。與載藥丸芯（圖1.9)相比瓜爾膠衣層可以顯著延緩5-FU

的釋放。

3.1.3.3釋放介質pH的影響

瓜爾膠包衣小丸在不同介質中的釋放曲線見圖1.13?？梢钥吹剿幬锏尼?放速率與介質的pH值無關，四條釋放曲線的f2均大于70，這與藥物和瓜爾 股的性質有關，5-FU為水溶性藥物，在四種介質中的溶解度均在18mg/ml 左右，而瓜爾膠為非離子型多糖，在pH<10范圍內，它遇水形成粘稠膠體 的能力與pH值無關[291。 

pH6‘5PBS

s— pH7.4PBS pH6.8PBS 0.1MHCI

02468101214

T ime (h)

Fig. 1.13 Release profiles of 5-fluorouracil from guar gum coated pellets in different dissolution

media.

3.1.3.4瓜爾膠水解酶的影響

圖1.14表明，半乳甘露糖苷酶可以引發(fā)瓜爾膠的降解，與對照組相比， 在含有半乳甘露糖苷酶的介質中，5-FU可以更為迅速地從小丸中釋出。兩條 釋放曲線的色為32,00，差異明顯，

3.2Eudragit FS30D包衣小丸的評價

用于口服結腸定位釋藥系統的pH敏感材料主要為丙烯酸樹脂，其中 Eudragit S100和EudragitFS30D以其在大于pH 7溶液中溶解的特性，備受研 究者的青睞。近年來大多數研究均采用EudragitSlOO,它既可用于有機溶劑 包衣也可采取水性包衣，但須自行配制水分散體。由于Eudragit S100和 

EudragitFS30D的組成及制備工藝不同，它們在實際應用中的用法不盡相同。 EudragitSlOO的玻璃轉化溫度較高，在進行水性包衣時需加入較多的增塑劑 才能形成連續(xù)緊密的衣膜。以增塑效果最好的檸橡酸三乙酯為例，當檸檬酸 三乙酯用量達到40-50°/。，才能形成完好的衣膜。而對于EudragitFS30D而言， 商品本身已為水分散體，加水稀釋后即可用于包衣。并且EudragitFS30D的 最低成膜溫度很低僅為14°C,玻璃轉化溫度為48°C，因此包衣操作的溫度也 較低在30°C左右即可。由于EudragitFS30D的成膜性好，盡管它為水分散體， 但可以不加或最多加入2-5%梓檬酸三乙酯作為增塑劑?？紤]到包衣操作的方 便性，本研究采用EudragitFS30D作為pH敏感包衣材料。

Eudragit FS30D是固含物為30%的曱基丙烯酸、丙烯酸甲酯和曱基丙烯 酸曱酯（1:1:1)共聚物的水分散體，其溶解閾值為pH27。FS30D包衣液的 配制簡單，加水稀釋至固含物為10%即可用于包衣。因此僅考察增塑劑、包 衣增重及熱處理時間對FS30D包衣小丸釋放度的影響。

3.2.1增塑劑的影響

選用產品推薦的檸檬酸三乙酯為增塑劑，用量分別為5%和0%時小丸（包 衣增重為20%)在pH值梯度變化的釋放介質中的釋藥行為，結果見圖1.15。 兩條釋放曲線重合，^為93.20，因此在以后的包衣液中均不加增塑劑。

o o o o

0 8 6 4

-■— without TEC -A— with TEC

3.2.2包衣增重的影響

制備包衣增重為19.79%, 31.00%, 39.80%的EudragitFS30D包衣小丸， 基于瓜爾膠包衣的口服結腸定位釋藥系統，分別考察它們在0.1mol/L HC1、pH6.8PBS的釋藥行為（圖1.16)及梯度pH 介質中(模擬體內胃腸道的pH環(huán)境)的釋藥行為（圖1.17)。從圖1.17可以看 出，包衣增重不同的3種小丸在最初的4 h，即2 h 0.1mol/L HC1及2 h

100

80

3

3 60

u

5 40

•FS30D19.79%

-FS30D31.00%

-FS30D39.80%

20

o o o o

8 6 4 2 paseufaj }uauJv&

2

Time (h)

10

Time(h)

pH6.8PBS中均不釋藥。而當釋放介質更換為pH 7.4PBS后，藥物在0.5 h時 的累計釋放量均已達到97%。圖1.16A、B進一步表明了 3種包衣增重的 Eudragit FS30D 衣膜在 O.lmol/L HC1 及 pH6.8PBS 中耐受情況。在 O.lmol/L HC1中，Eudragit FS30D衣膜至少可以耐受8 h, 12 h的累計釋放量也僅達到 5 %左右。在pH6.8PBS中，Eudragit FS30D衣膜可以保護藥物不釋放至少8 h, 而在8h之后，隨著衣膜厚度的減小，藥物的釋放量增加，但對于增重31.00 %和39.80 %的包衣小丸而言，在12h的累計釋放量也僅達到5 %左右。

Fig. 1.16 Release profiles of 5-fluorouracil from FS30D coated pellets (A) in O.lmol/L HC1, 12h; (B)

100

o o o o

8 6 4 2

pdsBwPJ ISUJ3Q,

■FS30DI9.79%

-FSJ0D31.00%

-FS30D39.80%

in pH6.8 PBS, 12h.

0123456

Time (h)

Fig. 1.17 Release profiles of 5-fluorouracil from FS30D coated pellets in consecutive pH gradient release medium (O.lmol/L HC1,2h; pH6.8,2h; pH7.4, lh).

以上試驗結果可以看出，Eudragit FS30D作為一種pH敏感包衣材料（pH 閾值為7，即在pH>7的環(huán)境下容解）對環(huán)境的pH的響應很靈敏，它可以保 護藥物在低于其溶解閾值以下的pH環(huán)境不釋放，而在高于溶解閾值的pH環(huán) 境中衣膜快速容解，藥物迅速釋出。在本文以后的試驗中，固定Eudragit FS30D包衣增重在30°/<u

于40°C分別對包衣增重為30%的小丸進行0、2、6和12 h的熱處理后 進行藥物釋放度的測定，結果見圖1.18。未作熱處理的包衣小丸4h的釋藥量 在8%左右，而熱處理2h、6h和12h后小丸的釋放曲線基本重合，4h的累計 釋藥量均小于1%,表明40。(：下熱處理2h即可使膜完全愈合。因此如無特殊 說明，本文中的EudragitFS30D包衣小丸均采用2h的熱處理工藝。

Time (h)

Fig. 1.18 Release profiles of 5-fluorouracil from FS30D coated pellets with different thermal curing time in consecutive pH gradient release medium (O.lmol/L HC1,2h; pH6.8,2h; pH7.4, lh).

3.3Eudragh FS30D/瓜爾肢雙重包衣小丸的性狀及體外釋藥評價

圖1.19A為EudragitFS30D/瓜爾膠雙重包衣小丸在電鏡下的剖面圖。從 圖中可以看到載藥層致密均勻；Eudragit FS30D衣層為光滑、連續(xù)的衣膜， 相比之下瓜爾膠衣層略顯疏松且呈不連續(xù)狀態(tài)，這與瓜爾膠和Eudragit FS30D衣層的性質密切相關，前者僅為瓜爾膠顆粒的堆積，而后者則形成了 完整、連續(xù)的衣膜。

outer enteric coat^. (Eudragit FS30D)

Inner coat (guar guin)^

drug-loaded layer♦ Inert nonpareil ♦

Fig. 1.19 Scanning electron micrographs of the cross-section of the pellet coated with Eudragit FS30D and guar gum (A) and the surface of guar gum-coated pellet (without outer enteric coating) before (B) and during (C) release test at a magnification of 100 folds.

r

00

o o o o

8 6 4 2 P3SSPJ lu9oJ<s>a.

0246810121416

Time (h)

——A一 FS30D/GG without g^lactomannanse —■一- FS30D/GGwith galactomannanse —uncoated—©— FS30D

Fig. 1.20 Release profiles of 5-fluorouracil from uncoated, Eudragit FS30D coated and Eudragit FS30D and guar gum (GG) double coated pellets in consecutive pH gradient release medium (O.lmol/L HC1,2h; pH6.8,2h; pH7.4, lh; pH6.5, lOh) with (9.68>^10'3U/ml) and without

galactomannanase.

圖1.20展現了在模擬胃腸道pH梯度介質中栽藥小丸、Eudragit FS30D 包衣小丸及Eudragit FS30D/瓜爾肢雙重包衣小丸的釋藥曲線。作為水溶性藥 物,5-FU在0.lmol/L HC1中5min左右即完全從栽藥丸芯中釋放出來;Eudragit FS30D包衣小丸在4h的釋藥時滯后，受釋藥介質pH值的促發(fā)FS30D衣膜迅 速溶解，并在30min內釋藥97%左右。由此可見憑借Eudragit FS30D衣層可 以有效、迅速的實現pH促發(fā)藥物釋放。但是消化道的生理特點降低了這種 簡單易行促發(fā)機制實際的有效性，即單純使用Eudragit FS30D包衣會造成藥 物在結腸前的提早釋放，這可能會引起副作用的增加及治療的失敗。而借助 于內衣層瓜爾膠的保護，Eudragit FS30D/瓜爾肢雙重包衣小丸在進入 PH7.4PBS后藥物并不會迅速釋出，大約lh后藥物開始釋放，釋藥時滯共為

5h。時滯之后小丸進入模擬結腸的釋放介廣中，無酶存在時瓜爾膠繼續(xù)阻止 藥物的釋放，在此后10h的釋藥量達80%左右，而當有瓜爾膠水解酶存在時， 時滯后lh的釋藥量就達到65%左右，并在此后的4h釋藥完全，酶促釋藥效

果顯著。

4.體內分析方法的評價

4.1方法的專屬性

5-FU的HPLC圖譜見圖1.21。由圖可知在建立的色譜條件下，5-FU和 內標的保留時間分別為6.4min和14.9min，內源性物質對藥物和內標的測定

無干擾。

4,2標準曲線及線性范圍

5-FU 血藥濃度標準曲線方程為 R=0.0003238C-0.0001716 (1=0.9996), 血藥濃度在20 ~ 800ng/ml范圍內線性關系良好。

4.3方法精密度

Tabl.8 Precision of the determination of 5-fluorouracil in dog^ plasma (n=5).

Cadded (ng/ml)Cdeteeted (ng/ml )RSD(°/〇)

5051.01 土 1.823.57

Within-day200207.89士 8.514.09

600612.39±25.384.14

5050.87± 1.843.62

Between-day200206.76^9.124.41

600610.05土】9 石5322

4.4方法回收率

Tab 1.9 Accuracy of the determination of 5-fluorouracil in dog’s plasma (n=5).

Cadded (ng/ml)Cdeiected (ng/ml)Accuracy (%)Mean 土 SDRSD (%)

5051.01±1.82102.02

200207.89 士 8.51104.95103.01 士 1.681.63

600612.39 土 25.38102.07

 

Tabl. 10 Extraction recovery of the determination of 5-fluorouracil in dog’s plasma (n^S).

c (ng/ml)Extraction recovery (%)Mean 土 SDRSD (%)

5071,38

20070.0972.03 ± 2.343.25

60074.63

4.6最低定量限

最低定量限為20ng/ml 4.7檢測限

檢測限為10ng/ml。

5.Eudragit FS30D/瓜爾肢雙重包衣的5-FU小丸犬體內的藥物動力學研究

5.1血藥濃度及藥動學參數

犬口服5-FU載藥小丸、Eudragit FS30D包衣小丸和Eudragit FS30D/瓜爾 股雙層包衣小丸后的血藥濃度數據分別見表1.11、表1.12和表1.13,平均血 藥濃度-時間曲線圖見圖1.22，藥動學參數見表1.14。

Tab. 1.11 Plasma concentration (ng/ml) of 5-fluorouracil in dog after oral administration of uncoated

pellets (n=5)

TimeNo. of subjectsX土 SD

(h)12345

0000000

0,0833044.40028.2129.5220.43±19.70

0.25138.22160.6229.64152.23122.43160.63士41.21

0.5319.50366.6317.93318.96336.99331.88 土 20.64

0.7590.2385.8255.6885.02130.1889.39土 26.61

128.7323.85021.3666.7728.13 士 24.21

1.5000025.615.55 土 11.21

2000000

2.5000000

3000000

4000000

5000000

7000000

9000000

Tab. 1.12 Plasma concentration (ng/ml) of 5-fluorouracil in beagle dog after oral administration ofFS30D coated pellets (n=5)

Time

(h)No. of subjects

12345

000000

100000

254,6400069.30

30102.63100.8494.700

400000

500000

600000

700000

800000

1000000

1200000

2400000

Tab. 1.13 Plasma concentration (ng/ml) of 5-fluorouracil in beagle dog after oral administration ofFS30D/GG double coated pellets (n=5)

TimeNo. of subjects

(h)12345

000000

i00000

200000

300000

400000

500000

600041.270

749.44 0000

8065.6139.79071.75

1000000

1200000

2400000

Tabl. 14. Mean (±S.D.) pharmacokinetic parameters of 5-fluorouracil iii beagle dogs (n=5) after oral administration of (dose 50 mg) of 5-FU formulations.

parametersUncoated pelletsFS30D coated pelletsFS30D/GG coated pellets

Cmax (ng/ml)332.00 土 20.8984.42±21.3453.57±14.44 *

T,nax (h)0.50±0.002.6 土 0.557.4±0.89 * *

vs uncoated pellets, at P<0.01; # vs FS30D coated pellets, at P<0.01

從表1.14可以看出3種小丸體內行為明顯不同。FS30D包衣小丸和 FS30D/瓜爾肢雙層包衣小丸的Tn^分別為2.6h和7.4h明顯長于栽藥丸芯 (0.5h ); Cmax分別為84.42ng/ml和53.57ng/ml也遠低于載藥丸芯 (332.00ng/ml )。由此可以看出兩種包衣的小丸均可不同程度地延緩藥物的釋 放，其中FS30D/瓜爾膠雙重包衣小丸的延緩效果更為顯著。

由于FS30D包衣小丸和FS30D/瓜爾膠雙層包衣小丸均只測得一個時間 點的血藥濃度，因此在圖1.22中僅對栽藥丸芯做藥-時曲線圖，而對于FS30D 包衣小丸和FS30D/瓜爾膠包衣小丸分別以不同時間下實際檢出的平均血藥 濃度柱狀圖表示藥物進入體循環(huán)的時間及濃度。雖然無法得到AUC和Tlag等 藥動學參數，但從圖1.22可以看出：與5min后藥物即進入體循環(huán)的速釋栽 藥丸芯相比，FS30D包衣小丸可延緩藥物釋放，但釋藥時滯過短僅為2~3h 左右，意味著藥物在到達結腸前便被釋出，無法有效實現結腸靶向釋藥的目 的；而雙重包衣小丸的口服吸收時滯在6~8h,與體外5h釋藥時滯接近，說 明雙層包衣可以保護藥物安全通過胃及小腸，到達結腸后才開始釋放藥物， 因此FS30D/瓜爾肢雙層包衣小丸具有較好的結腸定位釋藥特性。

5.2討論

EudragitFS30D包衣小丸的體外釋藥時滯■為4h，而犬口服EudragitFS30D 包衣小丸后最早于2 h在血中檢出藥物，表明小丸很快到達pH值>7環(huán)境， 衣膜溶解，藥物釋出。犬口服Eudragit FS30D/GG雙重包衣小丸后最早于給 藥后第6h在血中檢出現藥物，與體外5h的釋藥時滯接近。體外試驗中，兩

種包衣小丸的釋藥時滯僅差lh，體內試驗:卻有4h的區(qū)別，這可能與體內的 腸液量遠小于體外試驗有關，瓜爾膠吸水凝膠化速度變慢，因此同樣厚度的 瓜爾膠衣層可在Eudragit FS30D衣膜溶解后更長時間保護藥物不釋放，直至 小丸轉運至結腸酶降解瓜爾膠，藥物釋出。

用于評價結腸靶向釋藥系統的動物應在解剖學和生理學以及腸道微菌群 上與人密切相似。目前開發(fā)OCDDS的研究報道多選用大鼠、豚鼠和狗等動 物進行^，3(W4]。豚鼠因具有與人相似的結腸微菌群及相關酶系，被認為是最合 適作為生物可降解型OCDDS體內研究的動物模型，但因豚鼠胃排空較慢故 不常采用。本研究中曾經采用大鼠為模型動物，但由于一個劑量的小丸過多， 大鼠胃排空的速度極大減慢，因此最終選擇了犬作為體內評價的試驗動物。

證明藥物結腸靶向的最直觀可靠的方法是利用y-閃爍掃描法進行檢測， 因大多數藥物不含有適于Y-閃爍掃描研究的同位素，而需先標記藥物或將放 射性物質（如99mTc、ulIn)加入制劑。放射性同位素有固定的半衰期，因此 要求制劑的制備工藝簡單，制備周期短，并且應盡快進行體內試驗。本研究 選用的是小丸劑，包衣過程相對復雜，并且與單一的固體制劑不同，小丸在 胃腸道中分散較廣，判斷小丸的位置較為困難，鑒于這些原因，本文沒有進 行制劑的胃腸道轉運行為的研究。

4.小結

結腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，癌癥死亡的第二大主因，目前 一線化療藥物仍為5-FU的注射劑。5-FU0CDDS的成功研制將可以降低或消 除藥物在胃和小腸的吸收，提高病患局部的藥物濃度，減少或避免藥物進入 體循環(huán)引起的全身毒副反應，？文善5-FU對結腸癌的臨床治療效果。另外，水 溶性藥物由于落解度大易導致藥物過早釋放一直是OCDDS研究中的難點， 5-FU為水溶性藥物，基于瓜爾膠包衣的口服結腸定位釋藥系統，溶解度約為18mg/ml (溶解度與介質的pH無關），其 OCDDS的成功研制為其它藥物OCDDS的設計提供了可行有效的新思路。

本章采取pH敏感-酶促發(fā)雙重策略，分別用pH敏感材料Eudragit FS30D 和可生物降解的天然多糖瓜爾膠對栽藥小丸進行雙層包衣。體內、外試驗結 果表明雙層包衣小丸的釋藥時滯均在5-6h左右，表明雙層包衣可保護藥物安 全通過上消化道，到達結腸后開始釋藥。兩種釋藥機制的共同控制使得5-FU 靶向于結腸釋藥更安全、有效^

本研究中選用了水溶液粘度最大的瓜爾膠作為可生物降解材料，采用瓜 爾肢醇/水混懸液噴霧包衣的工藝成功地將瓜爾膠包覆于栽藥小丸，解決了親 水性高分子材料難以用于小丸劑包衣的難題。

結腸靶向釋藥技術的關鍵在于保護藥物到達結腸后釋放，即給藥系統需 克服胃和小腸平均5h的轉運過程不釋藥。除了釋藥機制外，藥物的溶解性 質也成為給藥系統成功與否的關鍵。水溶性藥物的溶解度大，易被溶解后擴 散進入介質，往往造成藥物的提前釋放[1_2]。難溶性藥物的溶解度小，更易實 現5 h左右的釋藥時滯，但是較低的溶解度有時會引起藥物進入結腸后釋放 過慢甚至釋放不完全[>4]。第一章以5-FU為水溶性模型藥物，制備并評價 Eudragit FS30D/瓜爾膠雙重包衣的結腸定位釋藥小丸，本章以難溶性藥物吲 哚美辛為代表，采用相同的設計策略制備結腸定位釋藥小丸，考察體內外釋 藥行為，評價其結腸靶向性。通過比較5-FU和吲咮美辛2種結腸定位釋藥 小丸的處方組成及體內外釋藥行為，評價基于Eudragit FS30D/瓜爾膠雙重包 衣的pH敏感-酶促發(fā)雙重控制的結腸定位釋藥小丸的可行性。

Fluka Biochemika 內蒙古赤峰藥業(yè) Merck公司

江蘇太倉制藥廠 國際特品（香港）有限公司 上?；瘜W試劑采購供應站 上海Colorcon包衣技術有限公司 法國NP Phami公司 法國Rhodia公司 degussa R6hm 公司

(Eudragit FS30D)

半乳甘露糖苷酶(0.2U/mg) 萘普生（內標）

乙睛（色譜純）

1.材料

吲味美辛(批號020961)

聚乙烯吡咯烷酮（PVP^o)

聚乙二醇（PEG4000)

羥丙曱纖維素（HPMC, 5cPa-s) 蔗糖丸芯（PF101，710-850叫1) 瓜爾膠（guargum)

腸溶型丙烯酸樹脂水分散體德國

1.材料與儀器

用于HPLC的試劑為色譜純，鹽酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、醋酸鈉、 冰醋酸、梓橡酸等其他試劑均為分析純

2.儀器

JGM-H50氣流粉碎機華東理工大學

UV-2401PC型紫外分光光度計日本島津

BS210S 電子天平Sartorius

Sartorius

BS610S電子天平

85-2型恒溫磁力攪拌器

上海智威電器有限公司 自制

德國Glatt公司 浙江溫嶺市潘郎鼓風機廠 寧波石浦海天電子儀器廠 天津大學無線電廠 曰本Hitachi公司 德國安杰倫公司

微型流化包衣設備

GPCG1.1型流化包衣機

藍森牌離心式單相交流鼓風機

DDB-320多功能電子蠕動泵

ZRS-8G智能溶出儀

S-520掃描電子顯微鏡

Agilent 1100 Series高效液相色譜儀

(G1322ADEGASSER, G1311AQuatPump, G1313AALS, G1315B DAD) XW-80型旋渦混合器上海超聲波儀器廠

3•動物

Beagle犬，3，8.0±2.0kg,普通級上海市新岡實驗動物場

2.實驗方法

1.體外分析方法的建立

1.1IDM小丸的含量測定HPLC方法的建立 1.1，1色譜條件

色譜柱：VenusilXBPM-C18(4.6mmxl50mm，5(im)

流動相：乙腈：0.1M醋酸納緩沖液（pH5.0) = 40:60 流速：1.0mL/min 柱溫：40°C 檢測波長：320nm 進樣量：20ul

1.1.2標準曲線的建立

精密稱取IDM 50mg，加8ml曱醇超聲溶解后用pH7.4 PBS定容于250ml 量瓶，作為鮮備液。分別吸取一定體積的貯備液，作不同倍數的稀釋，所得 濃度（C)分別為 0.1、0.5、1、5、10、20、的標準溶液，HPLC 法 測定，以藥物峰面積（A)對濃度（C，pg/ml)作線性回歸，得標準曲線方

程。

U.3回收率試驗

精密稱取IDM 20、25、30 mg及處方量輔料各三份，置250 mL量瓶中， 加適量甲醇超聲溶解后用pH7,4 PBS定容至刻度，離心，濾過，取續(xù)濾液10 倍稀釋后，HPLC法測定，按標準曲線方程計算藥物的含量，與加入量比較， 計算回收率。

1.1.4精密度試驗

分別吸取一定體積的貯備液，作不同倍數的稀釋，所得濃度（C)分別為 0.5、5、20嗎/ml的標準溶液，在同一天內連續(xù)進樣5次及連續(xù)5天測定，分 別計算日內差、日間差。

1.1.5溶液的穩(wěn)定性

濃度為0.5、5、2〇ng/ml的標準溶液，室溫下放置不同時刻后進樣，測 定冷面積，考察該溶液的穩(wěn)定性。

1.1.6小丸含量測定

精密稱取相當于含IDM 25mg的小丸，在研缽中加適量的pH7.4 PBS后 充分研磨至完全溶解，轉移至100 ml量瓶中，加入適量曱醇超聲后用pH7.4 PBS定容。離心(3500rpm，15min)、過濾，續(xù)濾液稀釋后，HPLC法測定，

按標準曲線方程計算藥物的含量。

1.2吲咮美辛小丸體外釋放度測定HPLC方法的建立

1.2.1色譜條件（見本章實驗方法1.1 )

1.2.2標準曲線的建立

精密稱取 IDM 50 mg,別用 0.1M HC1、pH6.8、pH7.4 和 pH6.5 PBS 定容，

吸取一定體積的溶液，作不同倍數的稀釋，HPLC法測定，以藥物峰面積（A) 對濃度（C, pg/ml)作線性回歸，得標準曲線方程。

1.2.3釋藥介質中的穩(wěn)定性（37°C)

釋藥標準曲線上高、中、低三個濃度的標準液，分別于不同時刻進樣測 定峰面積，考察釋藥過程藥物的穩(wěn)定性。

1.2.4釋藥回收率試驗

精密稱取IDM 50 mg置于100 ml量瓶中，再稱取相當于一個劑量的輔料 加入到上述量瓶中，分別加入0.1MHC1、pH6.8、pH7.4和pH6.5PBS,超聲

后定容。分別吸取一定體積的溶液，作不同倍數的稀釋，HPLC法測定，以 測得的量和加入的量比較，計算回收率。 1.2.5精密度試驗

釋藥標準曲線上高、中、低三個濃度的標準液，在同一天內連續(xù)進樣5 次及連續(xù)5天測定，分別計算日內差、日間差。

1.2.6檢測限

用已知濃度的樣品測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，按信嗓 比S/N=3時相應濃度確定檢測限。

2.載藥小丸的制備

2.1藥物的微粉化

采用水混懸液噴霧上藥，為了均勾上藥及防止混懸液中的固體顆粒堵塞 噴嘴，上藥前IDM經氣流粉碎機微粉化，粒徑<10叫1。

2.2載藥丸芯的制備

用微型流化床預試空白丸芯混懸上藥的處方和工藝后，用GPCG1.1型 Glatt流化床制備栽藥丸芯。將粘合劑PVP溶于水中（6%, W/V),攪拌下將 微粉化的藥物分散于其中制成混懸液，即可用于噴液上藥。上藥過程中需要 連續(xù)攪拌藥物混懸液。載藥丸芯的制備工藝如下：

微型流化床：空白丸芯10g，噴嘴直徑0.5mm,控制出口溫度41-44°C， 噴液速率l.Oml/min，在固定的風量和霧化壓力下進行噴液上藥。

Glatt流化床：空白丸芯lOOOg,底噴法，噴嘴直徑1mm,進風溫度65°C， 物料溫度51°C，流化風量110-116m3/h，噴霧•壓力1.5bar，噴液速率10-12g/min。 載藥結束后，繼續(xù)流化干燥5min，接著包一層HPMC隔離衣，增重約為2 % (W/W),防止小丸在貯存過程中粘結。最終制得小丸約1424g。用篩析法 通過稱重測定小九的粒徑分布，篩取18-24目的小丸用于包衣。

3.EudragitFS30D/瓜爾膠雙重包衣小丸的制備、釋藥影響因素及體夕卜評價

依次用粘度為5200 ~ 5500cps的瓜爾膠和Eudragit FS30D對H)M載藥丸 芯進行包衣。與第一章相同，雙層衣保護藥物通過胃和小腸至結腸后，酶促 發(fā)瓜爾膠水解，藥物釋出。由于IDM為難溶性藥物，期望較薄的瓜爾膠衣層 即達到同樣的保護作用„

3.1瓜爾膠包衣小丸的制備及釋藥影響因素

3.U包衣液的配制（同本文第一章實驗方法中的3.U)

3.1.2小丸包衣（同本文第一章實驗方法中的3.1.2)

3.1.3釋放度試驗

按中國藥典2005版規(guī)定的轉籃法測定。稱取適量包衣小丸（含IDM 25mg)，裝于轉籃中，置于900ml恒溫37±0.5°C的的釋放介質中，轉速為75 rpm，定時取樣5ml,同時補充等量同溫的新鮮介廣。樣品經0.45阿微孔濾 膜過濾后，續(xù)濾液經HPLC法測定，通過標準曲線計算藥物的累計釋放百分

率（Q )。

分別以 0.1mol/L HC1、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS 作為模擬胃、 小腸中前段（十二直腸和空腸）、小腸后段（回腸）及結腸pH環(huán)境的釋放介 質。含有半乳甘露聚糖酶（0.00968U/ml)的pH6.5PBS模擬在體結腸的酶環(huán)

境。

3.1.4釋藥影響因素

第一章中以5-FU為模型藥考察了瓜爾膠粘度對瓜爾膠包衣小丸釋藥行 為的影響，粘度在5200~ 5500cps時瓜爾膠衣層對藥物的阻滯能力最強，因 此在本章中重點考察包衣增重及釋放介質對瓜爾膠包衣小丸釋藥行為的影

響。

3.1.4.1瓜爾膠包衣增重的影響

考察不同包衣增重下小丸的釋放度。

3.1.4.2釋藥介質pH的影響

考察 O.lmol/LHCl、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS 四種釋放介質對

瓜爾肢包衣小丸釋放度的影響。

3.1.4.3瓜爾膠水解酶的影響

考察瓜爾膠包衣小丸在含有半乳甘露聚糖酶（0.00968U/ml)的pH6.5PBS

中的釋藥行為。 3.2EudragitFS30D包衣小丸的制備

本文第一章已經以5-FU為模型藥物對FS30D包衣小丸進行的篩選和評 價，在本章中依照第一章確定的包衣工藝對IDM載藥丸芯進行包衣及熱處 理，包衣增重至30%，并驗證包衣小丸在pH梯度的釋放介質中（0.1mol/L HC1,

2h、pH6.8PBS，2h和 pH7.4PBS, lh)的釋藥行為。

3.3Eudragit FS30D/瓜爾膠雙重包衣小丸的制備及體外釋藥評價 3.3.1小丸的包衣

依次按本章實驗方法中3.1.2和3.2項下的操作對載藥丸芯進行瓜爾膠內 層包衣及Eudragit FS30D外層包衣，包衣增重分別為44%和SO%.

3.3.2釋放度試驗

轉籃法測定。余下操作同3.1.3項下所述。分別以0.1mol/LHCl(2h)、 pH6.8 PBS(2 h)、pH7.4 PBS(1 h)和 pH6.5 PBS(12 h)作為釋放介質，模擬胃、 小腸中前段（十二直腸和空腸）、小腸后段（回腸）及結腸的pH環(huán)境。pH6.5 PBS中加入半乳甘露聚糖酶（0.0097U/ml)模擬在體結腸的酶環(huán)境。

4.掃描電鏡觀察

用掃描電鏡觀察FS30D/GG雙層包衣小丸的剖面結構。

5.體內分析方法的建立

IDM是臨床上常用的消炎鎮(zhèn)痛藥物，測定IDM血藥濃度的方法主要為 高效液相色譜法(HPLC)。本文參考文獻報道的分析方法[51，采用下述的反相 高效液相色譜法測定犬口服IDM制劑后的血藥濃度。

5.1色譜條件

色譜柱：VenusilXBPM-C18(4_6mmxl50mm，5(xm)

流動相：乙腈：0.1M醋酸鈉緩沖液（pH5.0) = 40:60 流* 速：1 .OmL/min 柱溫：40°C 檢測波長：320nm 內標：萘普生(10(ig/ml)

進樣量：20ul

記錄IDM與萘普生的峰面積比為響應參數，內標法定量。

5.2血漿樣品處理方法

精密吸取犬血漿500^1,萘普生(10pg/ml)10〇nl, 2%杵橡酸500叫于15ml 離心管，加入5ml乙謎，旋渦混合5 min,離心15min (3500rpm),取上層有機 層于5ml潔凈離心管中，于40°C水浴中用氮氣吹干，殘渣用lOOfil流動相溶

解，離心后取20pl進樣分析。 5.3血藥濃度標準曲線的建立

精密吸取犬血漿50(Hil，加入IDM標準溶液（100^1),使?jié)舛确謩e為50、 100、250、500、1000、2500、6000ng/ml,加入內標的方法同上，按血樣品 處理方法操作，以HPLC法測定，基于瓜爾膠包衣的口服結腸定位釋藥系統，以樣品峰面積與內標峰面積的比值R( A1DM/A 茶普生）對樣品濃度（C_)作線性回歸，求回歸方程。

5.4血藥濃度分析方法的評價

5.4.1方法精密度

取空白血漿5004數份，加入IDM標準溶液，使?jié)舛确謩e為50、500、 2500ng/ml,加入100^1內標溶液，按血漿處理方法操作并作色譜分析。一天 內重復五次，統計測定數據的相對標準偏差RSD,即為方法的天內精密度。 連續(xù)五天重復操作，統計測得數據的RSD，即為方法的天間精密度。

5.4.2方法回收率

取空白血漿500^1數份，加入5-FU標準溶液，使?jié)舛确謩e為50、500、 2500ng/ml，加入100^1內標溶液，每一濃度配置五份樣品，按血漿處理方法 操作并作色譜分析，以測得的濃度對實際濃度之比計算方法回收率。

5.4.3提取回收率

取空白血漿500^1數份，加入5-FU標準溶液，使?jié)舛确謩e為50、500、 2500ng/ml,每一濃度配置五份樣品，按血漿處理方法操作并作色譜分析，分 別與同濃度的5-FU標準溶液直接進樣的峰面積做比較，計算方法回收率。

5.4.4檢須扦艮

用已知濃度的樣品測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較，按信噪 比S/N=3時相應濃度確定檢測限。

5.4.5最低定量限

樣品中被測物能夠被定量測定的最低量，其測定結果應滿足一定的準確 度和精密度（兄狀20 % ,這20 % ,測定偏差E = (C *rC標)/C標xi〇〇 % )。

6.Eudragit FS30D/瓜爾肢雙重包衣的IDM小丸在犬體內的藥物動力學研究

6.1研究對象

Beagle犬5只，丄8.0±2.0kg,普通級

6.2試驗制劑與參比制劑

受試制劑：FS30D/GG雙重包衣小丸：FS30D層包衣增重30%, GG層包衣 增重44%。

參比制劑：載藥小丸

FS30D包衣小丸，包衣增重30%。

6.3試驗設計 服藥方法：

采用自身對照交叉試驗設計，洗凈期為1周。5只犬，禁食過夜（18h), 次曰清晨空腹給藥(含IDM 25mg)，用10ml水灌胃。由于本章Eudragit FS30D/ 瓜爾肢雙重包衣小丸和后文第四章中瓜爾肢-乙基纖維素包衣小丸的犬體內 藥物動力學研究均以IDM載藥小丸為參比制劑，因此兩部分藥物動力學試驗 一起冗成。服藥方案見表2.1。

Tab2.1 Design of administration method of subjects receiving four formulations.

SubjectPhase of administration

iiimIV

IABCD

2BCDA

3CDAB

4DABC

5ACBD

Aruncoated pelletsB: FS30D coated pellets

C: FS30D/GG doubble coated pellets D: GG-EC mixed coated pellets

羊采集：

于服藥前后設定的時間從前肢靜脈取血1.2ml,置于肝素鈉離心管中， 8000rpm離心lOmin，取上清血槳于-20°C冷凍保存，待分析。

服用載藥小丸的取樣時間點：20min、40min、60min、1.5h、2h、3h、4h、 6h、 8h、 10h、 12h。

服用FS30D包衣小丸的取樣時間點：lh、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、 10h、 12h、 24h、 30h。

服用FS30D/GG雙重包衣小丸的取樣時間點：lh、2h、3h、4h、5h、6h、 7h、 8h、 10h、 12h、 24h、 30h。

樣品分析方法:

用本文建立的HPLC法測定血漿中的IDM濃度.

6.4數據處理

用梯形法計算AUC,實測法讀取*Tmax，用3p87軟件計算(Lagtime， Tlag)及平均滯留時間（MRT)，用t檢驗法對藥動學參數進行方差分析(方差 分析時AUC和C_經過對數轉換）。

3.結果與討論

1.體外分析方法的評價

1.1IDM含量測定分析方法的評價 1.1.1含量測定標準曲線

在pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，IDM在0.1 ~ 40pg/ml的范圍內，藥物峰面 積和濃度的線性良好，標準曲線方程為：A=26.6667C+0.5680 (尸0.9994)

1.1.2回收率試驗 結果見表2.2

Tab2.2 Accuracy of indomethacin in pH7.4 PBS.

Cadded (Hg’ml) Cdetected (終&^1)Accuracy (%)Mean 土 SDRSD(%)

87.86. 士 0.1198.25

1010.13±0.14101.30100.52± 1.991.98

1212.24 士 0.18102.00

1.1.3精密度試驗

Tab2.3 Precision of the determination of indomethacin in pellets. (n=5).

AddedDetctedRSD

(n_)(Hg/ml)(%)

0.50.49±0.036.12

Within-day55.05 士 0.09L78

2020.78士 0.231.11

0.50.50 土 0.024.00

Between-day54,94 士 0.122.43

2019.86i〇.432.17

1.1.4 IDM穩(wěn)定性試驗

濃度為0.5、5、2〇ng/ml的IDM標準溶液，室溫下放置0 h、6 h、12 h 后HPLC法測定，考察該溶液的穩(wěn)定性。

Tab2.4 Stabality of indomethacin in pH7.4PBS through 24h (n=3).

AddedDetcted (^g/ml)RSD

(Hg/ml)Oh6h12 hMean iSD

0.50.520.490.470.49 士 0.036.12

55.044.924.904.95 土 0.081.61

2019.9819.8519.7619.86 士 0.110.56

表明IDM在pH7.4PBS中12h內穩(wěn)定。

1.2IDM小丸體外釋放度測定方法的評價 1.2.1釋藥標準曲線

四種釋放介質中，IDM吸收度和濃度的線性曲線方程分別為： 0.1MHC1A=26.0417C+2.2813 (r=0.9998)濃度范圍：0.1 ~ 8pg/ml

0.1 ~ 40j^g/ml 0.1 ~40^g/ml 0.1 ?40 卩 g/ml

pH6.8PBSA=27.5482C+2.1322 (r=0.9997)濃度范圍

pH6.5PBSA=27.0270C+0.4216(r=0.9996)濃度范圍

pH7.4PBSA=26.6667C+0.5680(r=0.9994)濃度范圍

1.2.2IDM在釋藥介質中的穩(wěn)定性考察

37。(：水浴下不同時間IDM在四種釋放介質中的濃度見表2.5。

Tab2.5 Concentration of indomethacin in different dissolution media at different time (n=3).

O.lMHCi

AddedDetcted(M_)RSD

(Hg/ml)Oh2h4hMean ±SD

0.50.520.490.460.49 土 0.036.12

22.001.861.821 廉 0.094.76

88.017.857.517.79 士 0.263.34

pH6.8PBS

AddedDetcted(Hg/ml)RSD

(Hg/ml)Oh6h20 hMean 土 SD

0.50.520.500.470.50 士 0.036.00

55.015.014.95499 士 0.030,60

2020.0419.9519.8619.95±0.090.45

 

AddedDetcted (|ig/ml)RSD

(Hg/ml)Oh6h20 hMean ±SD

0.50.510.490.460.49 土 0.036.12

55.025.025.075.04 士 0.030.60

2019.7619.6719.7219.72 士 0.050.25

pH7.4PBS

AddedDetcted (ng/ml)RSD

(Hg/ml)Oh6h .20 hMean ±SD

0.50.510.500.470.49 土 0.024.08

55.055.035.005.03士0.030.60

2019.8719.8519.7619.82 士 0.060.30

表明IDM在體外釋放度試驗過程中穩(wěn)定性良好，分析方法有效可行。

1.2.3釋藥回收率及精密度試驗

IDM釋藥回收率見表2.6。測定方法的日內和日間精密度見表2.7。結果

表明，所建立的分析方法準確、可靠。

Tab2.6 Accuracy of indoraethacin in defferent dissolution media.

Cadded Hg/ml)C detectedAccuracy (%)Mean 土 SD RSD(%)

0.50.49 士 0.0398.00

0.1MHC122.05 士 0,08102.50100.42± 2.272.25

88.06±0.16100.75

PH6.8PBS0.50.48±0.0496

55.11 土0.13102.298.88^3.123.16

2019.69 士 0.7898.45

PH6.5PBS0.50.52±0.03104.00

55.08 土 027 ’101.60102.22士 1.571.53

2020.21±1.16101.05

0.50.51±0.04102.00

PH7.4PBS54.98 土 0.1799.60100.17 土 1.631.63

2019.78 土 0.3698.90

AddedWithin-dayBetween-day

(Hg/ml)Detcted (ng/ml)RSD (%)Detcted (卩 g/ml)RSD(°/〇)

0.50.49±0.024.680.49 土 0.036.12

0.1MHCI22.08 士 0.02U61.96土 0.031.53

88_06土0.132.017.86 土 0.091.15

0.50.49±0.012.370.50 士 0.036.00

PH6.8PBS55.08 士 0.122,395.04±0.163.17

2020,59 士 0.492.3920.27土 0.673.31

0.50.50 土 0.024.000.50±0,024.00

pH6.5PBS54.98 士 0.204.064.96 土 0.112.22

2020.20土0.753.7320.19土 0.733.62

0.50.49 士 0.012.250 廉 0.024.00

pH7.4PBS54.91 士 0.163.164.97±0.142.82

2020.07士 0.552.7219.86 土 0.432.17

1.2.4檢測限

檢測限為25ng/ml。

1.3討論

相同濃度下IDM的紫外吸收靈敏度遠低于5-RJ。一個劑量的IDM小丸 (25mg )在900ml釋放介質中釋放10% (藥物濃度為2.7pg/ml)時的紫外吸 收值僅為0.04左右（X=320nm)。本文的重點是考察制劑的延遲釋藥時滯，采 用紫外分光光度法測定藥物的累計釋放量會給試驗結果帶來較大誤差，因此 采用更為準確的HPLC法作為體外分析方法.

2.載藥小丸的評價

本文采用IDM水混懸液法在Glatt流化床中對粒徑分布為710-85〇nm的 空白丸芯噴霧上藥，上藥效率達93.42%,粒徑范圍在18~24目的載藥小丸 占98.35°/。（圖2.1),小丸的栽藥量為27.27%。本文第二章與第四章的研究 均采用同一批載藥丸芯。

測定載藥小丸在不同介質中的溶出度，結果見圖2.2。由于化學結構中羧 酸基團的存在，IDM在不同介質中的溶解度不同，隨著介質pH值的增高， 溶解度增大。因此載藥小丸在各介質中的溶出速度隨溶解度的增大而增大。 

IDM在pH7.4 PBS中，1 h完全溶出（pH7.4 PBS中IDM的溶解度約為 1.58mg/ml);在 pH6.5 PBS 和 pH6.8 PBS 中的溶出度近似(pH6.5 PBS 和 pH6.8 PBS中IDM的溶解度接近，約為0.54 mg/ml), 6 h藥物的溶出總量接近100%; 而在O.lmol/LHCl中6h藥物的溶出量不超過5%,此時載藥丸芯已經完全破 碎，藥物粉末沉積在溶出杯底，這是由于在O.lmol/LHCl中藥物的溶解度極 小，小于 10fig/ml。

3.EudragitFS30D/瓜爾膠雙重包衣小丸的評價

3.1瓜爾膠包衣小丸的評價

3.1.1包衣增重及釋藥介質pH對小丸釋放度的影響

由于IDM在介質中的釋藥行為與其溶解度有關，且在O.lmol/LHCl中藥

物的溶解度極小，pH6.5 PBS和pH6.8 PBS中的溶解度近似。因此僅采用pH6.5 PBS和pH7.4 PBS 2種釋放介質考察包衣增重對瓜爾肢包衣IDM小九釋藥行

為的影響。

從圖2.3和圖2.4可以看出兩種釋放介質中瓜爾肢衣層均可在不同程度上 延緩藥物的釋放。包衣增重相同時IDM小丸在pH7.4 PBS中的釋放快于在 pH6.5 PBS中的釋放。表2.8分別歹|J出在2種釋放介質中不同包衣增重小丸的 T10及T5G (藥物釋放10%和50%所需的時間）。隨著包衣層厚度的增加，T10 和T5G增大，在釋放較快的pH7.4PBS中，包衣增重為44%時即可實現T1()在 lh左右，這與第一章中以5-FU為模型藥，包衣增重達580%時的效果一致。 在各種瓜爾膠包衣增重下，與5-FU小丸相比，IDM小丸除了具有明顯長的 釋藥時滯外，藥物的釋放速度也更慢。以包衣增重為580°/。的5-FU小丸和包 衣增重為499%的IDM小丸為例，5-FU小丸在不含酶的釋放介質中2.5 h就 有50%的藥物釋出，而IDM小丸即使在釋放較快的pH7.4 PBS中，12h的釋 放總量也僅為45%左右?？傊?，瓜爾肢對難容性藥物的阻滯能力明顯強于對 水溶性藥物的阻滯。

024681012

Time (h)

—0% --e— 44% —93% —6— 184% -A— 311% -B— 499%

Fig.2.4 Release profiles of indomethacin from guar gum coated pellets in different coat weight gain in

pH7.4 phosphate buffer.

Tab2.8 Ti〇 and Ts〇 of guar gum coated pellets in different coat weight gain in pH6.5 and pH7.4

phosphate buffer.

Coat weight gain

44%93% 184%311%499%

T,〇(h)3.54.04.04.05.5

pH6.5

T5〇(h)8.513.816.319.0>20.0

T,〇(h)1.11.41.72.02.8

pH7.4 PBS

T5〇(h)4.04.76.09.8>12.0

Ti〇and Ts〇 were calculated by interpolating data of each individual release profile.

3.1.2瓜爾膠水解酶的影響

酶促型OCDDS的原理及優(yōu)勢在于結腸內微菌群可特異性地降解相關材 料，而保證釋藥系統成功定位于結腸釋放僅是OCDDS的任務之一，隨后藥 物的釋放速度和程度則直接關系到病灶局部的藥物濃度是否維持在有效濃度 之上，將最終影響治療效果。因此分別考察了 5種增重的瓜爾肢包衣小丸在 含有半乳甘露糖苷酶釋放介質中的釋藥行為（圖2.5)，篩選適宜的瓜爾膠內 衣層厚度。由圖2.5可以看出，5種包衣增重的小丸在酶存在時10 h的累積 釋放量分別為100%、100%、78%、45%和36°/。，包衣層越厚，小丸的釋藥 速度越慢。Krishnaiah等[~研制的不同包衣增重的IDM瓜爾膠壓制包衣片在 4%的腸內容物中10h的累積釋放量最大也僅有10%。采用壓制包衣技術制備 的可生物降解型OCDDS,包衣過程使用較大壓力，形成非常緊密的包衣層， 雖然可保護藥物安全通過胃和小腸，但是衣層的吸水溶脹速度過慢導致壓制

包衣片進入結腸后酶不易進入包衣層發(fā)揮降解作用。如果藥物的溶解度又較 低，釋藥速度就更加緩慢。本文所采用的流化包衣技術沒有引入外力，僅通 過瓜爾膠自身的粘性將瓜爾膠堆積于小丸表面，結構較疏松，在水性環(huán)境中， 瓜爾膠衣層易被水化，因而小丸在進入結腸后可以較快地發(fā)生酶降解作用。

(b)

⑷

鑒于瓜爾膠包衣增重為44%時，IDM小九在pH6.5 PBS和pH7.4PBS中 的T1()分別為3.5h和l.lh,可保護藥物在外衣層Eudragit FS30D溶解后不致 迅速釋出，將更多的IDM運送至結腸發(fā)揮治療作用。較小的包衣增重使得小 丸進入結腸后瓜爾肢衣層可被酶迅速降解，藥物以較快速度釋出，因此選擇 瓜爾膠內衣層增重44%,

—184%-withgalactomannanase^ ......_

311%-with galactomannanase

—184%-without galactomannanase311%-withoiit galactomannanase

(C)

(d) 

 

20

(e)

Fig2.5 Release profiles of guar gum coated pellets of indomethacin with different coat weight gain: (a) 44%, (b) 93%, (c) 184%, (d) 311%, (e) 499% in the absence and presence of galactomannanase in

pH6.5 phosphate buffer.

3.2Eudragit FS30D/瓜爾肢雙重包衣小丸的性狀及體外釋藥評價

分別對載藥丸芯進行瓜爾膠和Eudragit FS30D雙重包衣，基于瓜爾膠包衣的口服結腸定位釋藥系統，包衣增重分別 為44%和30%。圖2.6為FS30D/瓜爾股雙重包衣小丸在電鏡下的剖面圖。從 圖中可以看到瓜爾膠衣層疏松、粗糙，而載藥層致密、均勻。這是由于上藥 前IDM經微粉化后粒徑小于10pm,而瓜爾肢的粒後在300目左右„與第一 章中5-FU雙層包衣小丸相比，IDM小丸的內衣層瓜爾股增重很小，電鏡下 觀察到IDM小丸內、外衣層的厚度接近，整個小丸的粒徑很小僅為1.1 mm 左右„

圖2.7展現了在模擬胃腸道pH環(huán)境的梯度釋放介質中載藥小丸、Eudragit FS30D包衣小丸及Eudragit FS30D/瓜爾股雙重包衣小丸的釋藥曲線。作為難 溶性酸性藥物,IDM的溶解度與介質的pH值有關。IDM在0.1 mol/L HC1中 的溶解度小于1 〇Hg/ml，因此在pH梯度釋放介質中載藥丸芯最初2 h (0.1 mol/L HC1)的釋放總量小于4%,但在隨后2 h的pH 6.8 PBS中的釋藥量達 92.67%。對于Eudragit FS30D包衣小丸而言，FS30D衣膜保護藥物前4 h不 釋放，進入pH7.4 PBS后衣膜迅速溶解，并在30 min內釋藥76%左右，1 h 釋藥接近完全。而加入增重44%的瓜爾膠內衣層后，雙層包衣小丸在進入 PH7.4PBS后并不會迅速釋藥，在經過約為0.5 h的時滯后藥物開始緩慢釋放， 此時總的釋藥時滯為4.5 h;當雙層包衣小丸進入模擬結腸的釋放介質時（即 第5 h)，小丸的釋藥總量僅為5.5%，實現了保護藥物至結腸的目的。此后 在瓜爾膠水解酶的作用下，瓜爾膠降解，藥物迅速釋出，lh的釋藥量達55% 

enteric coat (EudragitFS30D)

(guar gum)

and guar gum at a magnification of 150 folds.

左右；如無酶存在，瓜爾股繼續(xù)阻止藥物釋放，15 h后釋藥完全。因此對于 難溶性藥物而言，少的瓜爾膠衣層增重（44%)既可以有效延緩藥物釋放， 也可以迅速經酶促發(fā)釋藥。

4.體內分析方法的評價 4.1方法的專屬性

IDM的HPLC圖譜見圖2.8。由圖可知在建立的色譜條件下，IDM和萘 普生的保留時間分別為6.8min和4.7min，內源性物質對藥物和內標的測定無

干擾。 

pellets.

4.2標準曲線及線性范圍

IDM血藥濃度標準曲線方程為R=0.001382C-0.002352 (r=0.9999)，濃 度在50 ~ 6000ng/ml范圍內線性關系良好。

4.3血藥濃度分析方法的評價 4.3.1方法精密度

Tab2.9 Precision of the determination of indomethacin in dog's plasma (n=5).

Cadded (ng/ml)Cdetected (ng/nil)RSD (%)

5049.38土 0.941.90

Within-day500510.19 土 6.541.28

25002543.67±30,811.21

5049.52±2.154.34

Between-day500519.58 土 7.942.12

25002532.63±14.380.56

4.3.2方法回收率

Tab2.10 Accuracy of the determination of indomethacin in dog^s plasma (n=5).

Cadded (ng/ml)C detected (ng/ml)Accuracy (%)Mean 土 SDRSD (%)

504938±〇.9498.76

500510.19土 6.54102.04100.84土 1.811.79

25002543.67±30.81101.72

 

4.3.3提取回收率

Tab2.11 Extraction recovery of the determination of indomethacin in dog9s plasma (n=5).

C (ng/ml)Extraction recovery (%)Mean ± SDRSD (%)

5085.36

50082.0985.01 ±2.763.24

250087.57

1.3.4檢測限

檢測限為25ng/ml。

1.3.5定量限

最低定量限為50ng/ml。

5,Eudragit FS30D/瓜爾肢雙重包衣的IDM小丸犬體內藥物動力學研究

5.1血藥濃度及藥動學參數

犬口服IDM栽藥小丸、Eudragit FS30D包衣小丸及Eudragit FS30D/瓜爾 膠雙重包衣小丸后不同時間的血藥濃度數據見表2.12、表2.13及表2.14,平 均血藥濃度-時間曲線見圖2.9,藥動學參數見表2.15。

Table2.12 Plasma concentration (ng/ml) of indomethacin in dog after oral administration ofuncoated pellets (n=5)

Time

(h)No. of subjectsX士 SD

12345

0000000

0.3331034.67241.89594.51747.61478.85619.51 士296.55

0.6672867.05587.70754.781896.711619.791545.21土924.39

15295.521619.791175.222863.024477.163086.14士1779.60

1.54135.643227.254500.864144.972783.643758.55土720.62

21663.004264.372855.211799.781741,852464.86士 1117.86

3880.421807.341540.22970.031001.841239.97土409.55

4323.81863.55645.88345.44422.10520.16±230.44

6180.47430.04358.70141.06195.41261.14土 125.79

8134.69164.35136.11111.14123.26133.91 士 19.77

10112.18119.11123.2858.9860.5794.83±32.25

1252.19049.760020.39±27.79

Table2.13 Plasma concentration (ng/ml) of indomethacin in dog after oral administration of Eudragit FS30D coated pellets (n=5)

Time

(h)No. of subjectsX士SD

12345

0000000

10048.49009.70士 21.67

23698.833676.26709.622975.29668.532345.59士 1540.28

31076.741451.713088.401050.792946.461922.34士 1013.51

4317.43664.72484.29484.63930.38576.98土232.63

5387.96357.88201.70200.32494.49328.64士 126.93

6300.25304.69139.45219.32448.93282.45士 114.32

7259.27333.19349.82248.39349.39308.77土 50.05

8168.21586.78102.40154.16281.27258.41±194.52

10408.00554.18713.42529.00512.94542.92土 110.04

12637.54498.29560.03560.37410.50533.28士 84.56

24104.17165.72251.42261.57204.31197.36土 64.67

30097.2452.9742.1652.6449.16±34.64

Table2.14 Plasma concentration (ng/ml) of indomethacin in dog after oral administration of Eudragit FS30D/GG double coated pellets (n=5)

TimeNo. of subjects

(h)12345

0000000

1000000

2000000

358.98247.3450.41276.29240.42174.69±110.41

4131.90533.2798.881454.21650,34573.72土 548.51

5404.781073.171421.831381.331515.591159.34土453.28

6688.601163.92929.19889.961001.84934.70士 172.95

7694.40825.82702.89562.09422.10641.46士 154.10

8445.07492.79318.05286.94303.38369.25土 93.20

10431.61390.89440.20495.02213.72394.29土 107.54

12372.18379.58414.54466.78245.02375.62士 82.02

24268.1880.26228.6850.0682.95142.03土 98,98

30053.8061.84056.3234.39士 31.53

Tab2.15. Mean (±S.D.) pharmacokinetic parameters of indomethacin in beagle dogs (n=5) after oral administration of (dose 25mg) of IDM formulations.

ParametersUncoated pelletsFS30D coated pelletsFS30D/GG coated pellets

AUC〇.〇〇(ng/mIh)8779.40土 1133.9413074.11土709.308852.81 士990.12 #

C,™x (ng/ml)4665.27±541.383296.87土390.721295.51±354.50*#

T陳(h)1.48 士 0.392A6±0A95.41±0.77*#

T.ag(h)0.26±0.070.99 士 0二02.84 土 0.41

MRT(h)2.56 土 0.6710.60 土 2.0111.68±1.67*

* vs uncoated pellets, at P<0.01; # vs FS30D coated pellets, at P<0.01

-uncoated pellet s -FS30D coated pellets -FS30D/GG pellets

EudragitFS30D包衣小丸在體外釋放度試驗中第4h開始釋藥，而犬口服 后最早在第lh即在血中檢測到藥物，Tlag僅為0,99h，這與第一章中5-FU的 Eudragit FS30D包衣小丸的體內行為一致，最早于給藥后的2 h從血中檢出 5-FU。表明小丸口服后l-2h即被轉運到pH值>7的腸段。Eudragit FS30D/ 瓜爾膠雙層包衣小丸于給藥后3h在血中檢出藥物，Tlag為2.84h，短于體外試 驗中4.5h的釋藥時滯。雙層包衣小丸口服后很快即被轉運到pH值>7的腸液 中，Eudragit FS30D衣膜溶解，瓜爾膠暴露于腸液中，由于瓜爾膠層的增重 僅為44%,并且小丸在FS30D溶解后和進入結腸前一直處于pH值較高的環(huán) 境，這可能是引起體內釋藥時滯縮短的主要原因。當然也有可能因為犬胃腸 道的生理學特點與人不盡相同，固體制劑在其中的轉運時間與人體有異。

表2.16以F值CP=AUC〇_t/AUCVooX 1 〇〇%)間接揭示了 3種小丸在犬體內 不同時間的釋藥程度。對于載藥丸芯，3h的蘆值即達72.39% ; Eudragit FS30D 包衣小丸的F值在3h為25.37%, 5h達38.89%;而Eudragit FS30D/瓜爾肢雙 層包衣小丸的F值在4h僅為5.39%, 5h為15.81%。這表明口服3種小丸后 載藥丸芯可迅速釋出藥物；Eudragit FS30D衣層雖可在一定程度上延遲藥物

的釋放，但到達結腸前藥物的釋出過多（約40%左右）無法實現有效的結腸 定位釋藥；而Eudragit FS30D/瓜爾膠雙衣層可有效避免藥物在上消化道的釋 放，將更多的藥物（約85% )濃集于結腸釋出，可發(fā)揮更好的治療作用。

對于AUC而言，Eudragit FS30D包衣小丸最大，Eudragit FS30D/瓜爾 膠雙層包衣小丸與載藥丸芯無顯著性差異（p>0.01)。這與吲味美辛為脂溶性 藥物，在整個腸段均有較好的吸收有關。

Tab2.16. The fraction of AUC〇.t under different time against AUC〇-〇〇.

FormulationTime interval

0?3h0?4h0?5h

Uncoated pelletsAUC〇.t(ng/ml-h)

AUCo^ng/mlh)6355.417235.47

8779.408016.76

F72.39%82.41 %91.31 %

FS30D coated pelletsAUC〇.t(ng/ml-h)

AUC〇-〇〇(iig/ml.h)3316.794566.24

13074.115018.65

F25.37 %34.93 %38.89%

FS30D/GG coated pelletsAUC〇.t(ng/ml*h)

AUC〇-〇〇(ng/ml_h)103.04477.24

8852.811343.77

F1.16%5.39 %15.81%

F= (AUC〇V AUC〇^) xl〇〇%

5.2討論

體內驗證藥物的結腸靶向性一直是口服結腸定位釋藥系統研究的關鍵和 難點。本文選用犬做為動物模型，發(fā)現以Eudrgit FS30D為包衣材料的pH敏 感型OCDDS，不論是以5-FU還是以IDM為模型藥，在體內的釋藥時滯均 小于體外。這可能與以下兩種原因有關：1、小丸在犬胃和小腸的轉運時間小 于5h。2、犬小腸中部的pH值即在7以上。第一種可能性已被其他研究者所 驗證。以對乙酰氨基酚為模型藥的CODES™在犬體內的藥動學表明藥物延 遲吸收時滯為3h，而體外釋藥時滯為5h，而對照制劑（普通腸溶衣）0.5h即 入血吸收，表明犬的胃排空時間不到半小時[6-7]。分別以甘草皂甙和柳氮靖此 啶為模型藥的結腸靶向制劑PCDCS犬體內的藥動學試驗表明藥物的延遲吸收 時間分別為3.3h和3.5h小于體外5h的釋藥時滯[8-9]。另外1993年Davis等人 的研究表明犬小腸轉運時間僅有2h左右[1Q]。

本章制備的吲咮美辛Eudrgit FS30D/瓜爾膠雙層包衣小丸的粒徑僅在 1.1mm左右，因此以后的工作中可以選用大鼠為動物模型，考察不同動物的 轉運時間對體內釋藥時滯的影響，并可以進行不同時間藥物在胃腸道分布的 試驗，更加直觀地了解藥物在體內的動態(tài)變化。

另外為了延長體內的釋藥時滯，可以適當增加內衣層瓜爾膠的厚度，降 低達到結腸前藥物的前釋，更好的實現藥物的結腸靶向轉運。

4.小結

本章以吲哚美辛為模型藥進行了 pH-酶雙重促發(fā)的結腸定位釋藥小丸的 研究，體外釋放度試驗表明瓜爾膠內衣層的厚度在44%即可形成有效時滯， 與5-FU同種小丸相比，瓜爾肢層的厚度降低了 92%左右。體內試驗表明， 與栽藥小丸相比，EudrgitFS30D/瓜爾膠雙重包衣的吲哚美辛小丸可以顯著延 長藥物的Tmax、Tlag和MRT，并降低Cmax，實現了結腸靶向釋藥的目的。

結合第一章的試驗結果可知Eudrgit FS30D/瓜爾膠雙重包衣可以通過 pH-酶雙重釋藥機制保護難容性藥物IDM和水溶性藥物5-FU通過上消化道， 將大多數藥物運送至結腸后釋放。兩種溶解性能的藥物實現同樣的釋藥時滯 僅通過改變內衣層瓜爾膠的厚度，并且不同厚度的瓜爾膠層在結腸微菌群的 作用下均能迅速釋藥，使藥物富集于結腸局部，發(fā)揮更好的治療作用。

單純的pH敏感型結腸定位釋藥系統雖然制備簡單，但由于人胃腸道的 生理特點，藥物到達結腸前即會大量釋出，這會造成藥物的全身吸收增加、 結腸病變部位藥物濃度不足，導致治療的失敗。本文以EudragitFS30D/瓜爾 膠雙重包衣技術制備的結腸定位釋藥小丸采用pH敏感-酶促發(fā)兩種機制共同 控制藥物的釋放，使藥物可以更安全、有效地靶向于結腸釋放。

瓜爾膠的水凝膠性質可以在一定的程度上阻礙藥物的釋放但阻滯能力有 限。本部分將惰性包衣材料乙基纖維素（ethylcellulose，EC)引入瓜爾膠層， 利用它的疏水性，延長釋藥時滯，同時瓜爾股依然通過酶促機制釋藥?？刂?瓜爾膠和乙基纖維素的比例及包衣厚度實現延遲釋藥5 h。

時間依賴-酶促發(fā)雙重控制結腸定位釋藥小丸的設計原理為：瓜爾膠為水 溶性高分子材料，乙基纖維素為疏水性高分子材料，將二者混合后作為包衣 材料對載藥小丸進行單層包衣。其中瓜爾膠扮演著衣層中的親水通道，乙基 纖維素則為疏水阻滯屏障。當小丸進入水性環(huán)境后，包衣層中的瓜爾膠逐漸 被潤濕，形成親水凝膠通道，釋放介質經此通道向丸芯慢慢滲入，一定時滯 后（5h左右），載藥丸芯被潤濕，藥物沿親水通道釋出，即小九口服后約經5 h到達回盲部開始釋藥。當小丸進入結腸后，在菌群的酶解作用下，瓜爾膠 被水解，藥物自九芯釋出的屏障減少，釋藥速度加快。 

第三幸5-氟尿嘧啶時間依賴-酶促發(fā)雙重控制小丸

一.材料與儀器

1.材料

5-氟尿嘧啶載藥丸芯本文第一章制備

瓜爾肢（5200 ~ 5500cps )法國Rhodia公司

乙基纖維素水分散體（Surelease®E-7-19010)英國Colorcon公司

半乳甘露糖苷酶(0.2U/mg) 5-溴尿嘧啶（5-BU,內標）Fluka Biochemika Sigma公司

曱醇（色譜純）Merck公司

用于HPLC的試劑為色譜純，鹽酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉等其他試劑均為

分析純 2.儀器

JGM-H50氣流粉碎機 UV-2401PC型紫外分光光度計 BS210S電子天平 BS610S電子天平 85-2型恒溫磁力攪拌器 微型流化包衣設備 益森牌離心式單相又流鼓風機 DDB-320多功能電子蠕動泵 ZRS-8G智能溶出儀 S-520掃描電子顯微鏡華東理工大學 曰本島津 Sartorius Sartorius

上海智威電器有限公司 自制

浙江溫嶺市潘郎鼓風機廠 寧波石浦海天電子儀器廠 天津大學無線電廠 曰本Hitachi公司

Agilent 1100 Series高效液相色譜儀美國安杰倫公司

(G1322ADEGASSER, G1311A QuatPump, G1313A ALS, G1315B DAD) XW-80型旋渦混合器上海超聲波儀器廠

3.動物

Beagle 犬，3，8.0±2.0kg,普通級上海市新岡實驗動物場

.實驗方法

1.體外分析方法的建立（與第一章相同）

2.1瓜爾肢-乙基纖維素混合包衣液的配制

稱取適量瓜爾肢，用乙醇分散，攪拌下加入蒸餾水，形成4% (W/V)瓜 爾膠在醇/水（1/4, V/V)體系中的混懸液。然后加入一定量的Surelease,挽 拌均勻后即得瓜爾膠和乙基纖維素的混合包衣液。

2.2小丸包衣

載藥小丸10g加到自制微型流化床中，噴嘴直徑為0.8mm，控制出口溫 度為33±2°C,噴液速率為l.Oml/min,在固定的風量和霧化壓力下進行噴液 包衣，直至達到預設的包衣增重。包衣過程中需要連續(xù)挽拌包衣液。小丸包 衣完成后，將小丸置于60°C的烘箱中干燥6h。

2.3釋放度試驗

按轉籃法測定，余下操作同第一章實驗方法中3.1.3項下所述。除非另有 說明外，釋放介質均為PH6..5PBS，在pH6.5PBS中加入半乳甘露聚糖酶 (0.00968U/ml)來模擬在體結腸的酶解環(huán)境。

2.4影響釋藥的因素 2.4.1釋藥介質pH的影響

考察 O.lmol/LHCl、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS4 種釋放介質對

瓜爾膠-乙基纖維素包衣小丸釋放度的影響。

2.4.2瓜爾股-乙基纖維素比例及包衣增重的影響

瓜爾膠-乙基纖維素包衣小丸的釋藥行為受包衣處方中瓜爾膠與乙基纖 維素比例和包衣增重影響，以瓜爾肢與乙基纖維素的比例（A)和包衣增重 (B )為因素，以T5和丁9〇 (藥物釋放5%和90%所需要的時間）為效應，進 行析因設計/效應面優(yōu)化，篩選較優(yōu)處方。因素水平及析因實驗安排見表3.1。

Tab.3.1 Factors and levels table of 3X4 factorial design for optimizing preparation method of

GG-EC mixed coated pellets.

AGG:ECB Coat weight gain

B! 100%B2 200%B3 300%B4 400%

Ai1/1A,B,Ai B2A,B3Ai B4

A21/2A2B,A2 B2A2 BJA2B4

A31/4A3B,A3B2A3 B3A3 B4

在pH6.5PBS中加入半乳甘露聚糖酶（0.00%8U/ml)來模擬在體結腸的 酶環(huán)境，考察較優(yōu)包衣處方小丸在其中的釋藥行為。

3.掃描電镋觀察

分別在掃描電鏡下觀察瓜爾膠-乙基纖維素包衣小丸、瓜爾膠包衣小丸和 乙基纖維素包衣小丸的表面形態(tài)及在釋放度試驗中瓜爾膠-乙基纖維素包衣 小丸的表面形態(tài)。

4.體內分析方法的建立（同第一章）

5.瓜爾膠-乙基纖維素包衣小丸在犬體內的藥物動力學研究

5.1研究對象

Beagle 犬 5 只，8.0±2.0kg,普通級

5.2試驗制劑與參比制劑

受試制劑：GG-EC包衣小丸，GG:EC=1:2,包衣增重405%。

參比制劑：載藥小丸 5.3試驗設計 服藥方法：

采用自身對照交叉試驗設計，洗凈期為1周。5只犬，禁食過夜（18h), 次曰清晨空腹給藥(含5-FU50mg),用10ml水灌胃《由于本章的瓜爾膠-乙基 纖維素包衣小丸和本文第一章中的Eudragit FS30D/瓜爾肢雙重包衣小丸的犬 體內藥物動力學研究均以5-FU載藥小丸為參比制劑，因此兩部分藥物動力學 試驗一起完成。服藥方案見第一章表1.1 (p23)。

血樣采集：

于服藥前后設定的時間從前肢靜脈取血1.2ml,置于肝素鈉離心管中， 8000rpm離心lOmin ,取上清血槳于-20°C冷凍保存，待分析。

服用栽藥小丸的取樣時間點：5min、15min、30min、45min、lh、1.5h、 2h、 3h、 4h、 5h、 7h、 9h„

服用瓜爾膠-乙基纖維素包衣小丸的取樣時間點：lh、2h、3h、4h、5h、 6h、 7h、 8h、 10h、 12h、 24h

樣品分析方法：用本文第一章建立的HPLC法測定血漿中的5-FU濃度。 5.4數據處理

直接讀取*Tmax，并用t檢驗法對兩參數進行方差分析（其中Cmax 經對數轉換）。

3.結果與討論

1•體內、外分析方法的評價（同第一章）

2.1包衣液處方的選擇及配制和包衣小丸的制備

在瓜爾膠衣層中引入水不溶性包衣材料，來延長小丸的釋藥時滯至5h左 右。基于瓜爾膠包衣的口服結腸定位釋藥系統，常用的水不溶性包衣材料有醋酸纖維素、乙基纖維素和滲透型丙稀酸樹 脂（EudragitRL、EudragitRS、EudragitNE) [1]。乙基纖維素形成的衣膜在 水中的通透性最小，因此本文以它作為混合衣層中的疏水性高分子材料。

瓜爾肢和乙基纖維素的溶解性質相反：乙基纖維素不溶入水，溶于乙醇、 丙酮、異丙醇等多數有機溶劑，而瓜爾膠僅在水中溶解，不溶于任何有機溶 劑。若采取有機溶劑包衣，瓜爾肢完全呈分散狀態(tài)，包衣過程中易與乙基纖 維素的有機溶液分離，干燥后成粉而導致包衣效率低，且會引起衣層中瓜爾 膠和乙基纖維素的比例發(fā)生改變。為此采用水性包衣工藝，將乙基纖維素的 水分散體Surelease和瓜爾膠水/醇體系的混懸液直接混合（見第一章），攪拌 均勻后即可用于小丸的包衣。

Surelease的最低成膜溫度（MFT)為23°C,理想的包衣溫度為34-38°C[2]， 因此混合包衣的操作溫度控制在出口溫度為33±2°C，高于瓜爾膠單獨包衣的 操作溫度。

2.2釋藥影響因素 2.2.1.釋藥介質pH的影響

瓜爾股-乙基纖維素混合包衣小丸（GG:EC=1:2，包衣增重為419%)在 O.lmol/LHCl、pH6.8PBS、pH7.4PBS 和 pH6.5PBS 中的釋放曲線如圖 3.1。4 條曲線兩兩間的f2均大于80，表明包衣小丸的釋藥速率不受釋放介質pH值 的影響。5-FU在4種介質中的溶解度近似（約為18mg/ml),包衣材料瓜爾 膠和乙基纖維素對pH無選擇性，因此5-FU從瓜爾肢-乙基纖維素包衣小丸 中的釋放程度和速度僅和包衣處方中乙基纖維素的比例和衣層的厚度有關。 為簡便起見，本章中的釋放度試驗均選用PH6.5PBS作為釋放介質。

2.2.2瓜爾膠和乙基纖維素的比例及包衣增重對小丸釋放度的影響

根據析因實驗設計制備的包衣小丸的釋藥曲線分別見圖3.2、3.3和3.4。 從圖中可以看出，12種處方的小丸均具不同長短的釋藥時滯，并且藥物延遲 釋放的時間隨著乙基纖維素在衣層中所占比例的增大及衣層厚度的增加而增

加。

表3.2為析因設計-效應值表。以Statistica 6.0為統計軟件，分別按多元 線性方程yH^o+b^x丨+b2x2和多元非線性方程y^bo+b^+b^ +b3x12+b4x22+ b5x :Jx2擬合。

Time (h)

Fig3.1.Release profiles of 5-fluorouracil from GG-EC mixed coated pellets (GG:EC=1:2, CWG419%) in O.lmol/L HC1、pH6.8、pH7.4 和 pH6.5 phosphate buffer

Fig3.2.Release profiles of 5-fluorouracil from GG-EC mixed coated pellets (GG:EC=1:1) with different coat weight gain (CWG) in pH6.5 phosphate buffer.

Time (h)

Fig3.3.Release profiles of 5-fluorouracil from GG-EC mixed coated pellets (GG:EC=1:2) with ditferent coat weight gain (CWG) in pH6.5 phosphate buffer.

Time (h)

Fig3.4.Release profiles of 5-fluorouracil from GG-EC mixed coated pellets (GG:EC=1:4) with different coat weight gain (CWG) in pH6.5 phosphate buffer.

Tab. 3.2 Experimental design table (columns 1-3) with experimentally determined values of different dependent variables (columns 4-5)

Formulation

No.GG:EC

XiCoat weight gain

x2T5

(h)丁90

(li)

11/1111%0.62.0

21/1208%1.12.6

31/1314%1.73.4

41/1438%2.35.2

51/2100%2.05.2

61/2200%3.46.7

71/2313%4,51.1

81/2419%5,59.8

91/4100%3.08.5

101/4198%4.010.1

111/4318%6.013.9

121/4401%8.116.0

T5 and T90 were calculated by interpolating data of each individual release profile.

各效應對兩因素各水平的回歸方程分別如下：

多元線性:

T5 : y= (3.868286) + (-5.24388)* Xj + (1.025249)*x2(r=0.9544669)

T9〇 : y= (10.13396) + (-11.5362)* x, + (1.610443)*x2(產0.9579517)

多元非線性：

T5 :y= (2.436130) + (-4.48829)=^ + (1.828711)*x2+ (2.325300)* x!2

+ (0.009615)* x22+ (-1.42958)* x !x2(r=0.9890579)

T9〇:y= (12,681484) + (-25.508375)*x1 + (1.8738723)*x2 + (15.01217)*X!2

+ (0.1824542)*X22+ (-2.0470277)*X!X2(r=0.9950415)

其中，y代表T5和T9〇，x!*x2代表瓜爾膠-乙基纖維素的比例和包衣增 重兩因素。二項式擬合效果更為理想。對二項式中的6個系數進行方差分析 (ANOVA)通過t檢驗在p<0.2水平上拒絕某些系數，簡化方程。效應T5 和T9Q簡化前后的各系數值表分別見表3.3、3.4、3.5和3.6

Tab.3.3 Parameters of Ts valued by nonlinear binomial.

bOblb2b3*b4*b5

Estimate2.436130-4.488291.8287112.3253000.009615-1.42958

Std.Err.L0751712.938030.6035922.1740450.1153600.34800

t(6)2.265808-1.527653,0297151.0695730.083348-4.10800

p-level0.0640350.177460.0231060.3259400.9362860.00630

r=0.98906;* p<0.2 rejecting the hypothesis

Tab.3.4 Parameters of T5 after simplified.

bOblb2b5

Estimate1.680228-1.539661.869726-1.41320

Std.Err.0.6097260.922210.2159970.32033

t(8)2.755713•1.669538.656245-4.41175

p-level0.0248390.133560.0000250.00225

r-0.98695

Tab.3.5 Parameters of T90 valued by nonlinear binomial.

bOblb2b3b4*b5

Estimate12.68148-25.50841.87387215.012170.182454•2.04703

Std.Err.1.447783.95620.8127702.927480.1553390.46860

t(6)8.75926-6.44762.3055395.128011.174557-4.36839

p-level0.000120.00070.0606380.002160.2846730.00473

r=0.99504;* p<0.2 rejecting the hypothesis

Tab.3.6 Parameters of T90 after simplified.

bOblb2b3b5

Estimate11.81977-25.6591 2,75740614.90504-1.92296

Std.Err.1.281524.0600 0.3160473.004350.46875

t(7)9.22322-6.3200 8.7246604.96115•4.10227

p-level0.000040.0004 0.0000520.001640.00456

r=0.99390

因此簡化的方程分別為

T5 : y = (1.680228)+ (-1.53966)*XI + (1.869726)*X2+(-1.41320)* X!X2 T9〇: y = (11.81977) + (-25.6591)^! + (2.757406)*x2+ (14.90504)*Xl2 + (-1.92296)*X1X2

根據簡化后的二項式擬合描繪各效應對兩因素的效應面，見圖3.5和圖 3.6。由圖可知幾和！^隨EC比例的增加和包衣增重的增大而增大，要實現 安全轉運藥物至結腸的目的，基于瓜爾膠包衣的口服結腸定位釋藥系統，應滿足T產5h。為了考察瓜爾膠-乙基纖維素混 合衣層對結腸內瓜爾膠水解酶的敏感性，應用Statistic6.0描繪各效應面的等 高線，將各等高線重合（圖3.7)，在丁5>511區(qū)域內(圖3.7中黑線左上方區(qū)域) 確定不同T9〇的3個處方：GG: EC為1:2，包衣增重400%、GG: EC為1:4, 包衣增重300%和GG: EC 1:4，包衣增重400%進行下一步研究。 

Fig3.6 The predicted response surface of T90 as a function of the percentage of the radio of GG/EC

and coat weight gain.

Fig3.7 Overlapping figure of the contour plots of Fig3.3?3.6.

按優(yōu)選處方制備包衣小丸，進行釋放度考察，對預測結杲進行驗證，結 果見表3.7。由表3.7可知3種處方的實際值和預測值的偏差均小于10%,因 此采用析因設計-效應面優(yōu)化法篩選處方具有較好的預測效果。

IndexObserved valuesPredicted valuesDeviation

T55.105.62-9.25%

GG:EC=1:2,405%

T909.76-2.30%

T55.755.89-2.38%

GG:EC=1:4, 303%

丁9012.00-9.29%

T57.807.474.42%

GG:EC=1:4, 407%

T9016.2515.604.00%

2.2.3半乳甘露糖苷酶對瓜爾膠-乙基纖維素包衣小丸釋放度的影響

首先考察GG:EC ( 1:2 )，包衣增重405%、GG:EC (1:4 )，包衣增重303% 和GG:EC (1:4 )，包衣增重407% 3種處方的小九經過胃和小腸的轉運進入結 腸后經酶促釋藥的速度。由于瓜爾膠-乙基纖維混合包衣小丸的釋放度與介質 的pH值無關，方便起見，以pH6.5PBS5h作為結腸前的釋放介質。5h后在 PH6.5PBS中加入半乳甘露聚糖酶（0.00%8U/ml)來模擬在體結腸的酶環(huán)境。

3種包衣處方小丸的釋放度結果見圖3.8、圖3.9和圖3.10。從圖中可看 出每種包衣小丸在含酶的釋放介廣中的釋藥速度均有一定程度的加快。由于 包衣層中引入乙基纖維素，瓜爾肢含量降低，因此瓜爾膠-乙基纖維素的混合 衣層對酶的敏感度降低。與本文第一章中包衣增重為580%的瓜爾膠包衣小 丸相比，包衣增重405%的GG-EC( 1:2)混合包衣小丸、包衣增重303%的 00祝（1:4)混合包衣小丸和包衣增重407%的0。疋(：（1:4)混合包衣小 丸進入模擬結腸的釋放環(huán)境lh后的釋藥量分別為13.68°/。、7.71%和1 %,遠 低于瓜爾膠包衣小丸65 %的釋藥量。

圖3.10顯示，與增重303%的GG-EC( 1:4)包衣小丸和增重405%的GG-EC (1:2)包衣小丸相比，增重407%的GG-EC( 1:4)包衣小丸的釋藥時滯約為 7h左右。最初的設想是希望包衣小丸有足夠長的釋藥時滯（>5h)，但在進入 含酶的環(huán)境中能夠很快開始釋藥，即大于5h的時滯可以避免由于胃和小腸轉 運時間的變異引起的藥物提早釋放，而衣層中瓜爾膠對酶的敏感性可以使過 長的釋藥時滯在進入結腸后失效，藥物經酶促發(fā)機制開始釋放并且以更快的 速度釋出。然而圖3.10的結果表明這種設想未能實現。小丸在經過前5h(胃、 小腸轉運）的釋放后進入含瓜爾膠水解酶的人工結腸液，酶的存在并未終止 過長的釋藥時滯，酶促發(fā)藥物釋放直到8h之后才開始。

圖 3.8 (GG:EC = 1:2，包衣增重 405%)和圖 3.9 (GG:EC = 1:4,包衣增

o o

6 4

P3S«3I<U.I luuaidOM

20

重303%)表明，兩種小丸均有5 h左右的釋藥時滯，進入含酶的釋放介質后， 瓜爾膠水解，藥物的釋出加快。盡管2種小丸的釋藥時滯相當，但由于瓜爾 膠和乙基纖維素的比例不同，二者在時滯之后的釋藥速度不同。GG:EC為1:2 的包衣小丸的衣層增重（405 % )顯著大于GG:EC為1:4的包衣小丸（303% )， 但進入瓜爾膠水解酶的環(huán)境中的釋藥速度更快，5 h內釋放完全，而后者需要 11 h才能釋放完全。因此選擇GG: EC為1:2,包衣增重為405%的小丸作為 最優(yōu)處方進行體內驗證。

024681012

Time (h)

Fig.3.9.Release profiles of 5-fluorouracil from GG-EC mixed coated pellets (GG: EC=1:4) in pH6.5

phosphate buffer. 

80 1

60

40

20

 

2.3討論 2.3.1瓜爾膠-乙基纖維素混合衣層阻滯藥物釋放的效果

瓜爾膠對藥物有一定的阻滯作用，但單獨使用無法滿足OCDDS 5h的釋 藥時滯。將水不溶性包衣材料乙基纖維素引入瓜爾膠衣層后，混合衣層阻滯 藥物釋放的能力明顯增強。當乙基纖維素達到一定的比例，混合衣層可以延 遲5h釋放藥物，實現靶向于結腸釋藥的目的。圖3.11將包衣增重接近的瓜 爾膠包衣小丸（第一章）和不同比例的瓜爾肢-乙基纖維素混合包衣小丸（本 章）在pH6.5PBS中的釋放曲線集中起來，更為直觀地展現了乙基纖維素對 藥物的阻滯作用。

Fig,3.11 .Release profiles of 5-fluorouracil from GG coated and GG-EC mixed coated pellets with different ratio of GG against EC in pH6.5 phosphate buffer. 

2.3,2瓜爾膠-乙基纖維素混合衣層的性質

大多數水分散體需要通過包衣后的熱處理工藝來促成衣膜的完全愈合， 但對于乙基纖維素的水分散體Surelease來說，衣膜的愈合可以在包衣過程中 完成[31。由于混合包衣液中的瓜爾膠為混懸液，粒徑在300目左右，無法在 包衣過程及通過熱處理工藝來促成完整、連續(xù)衣膜的形成，因此瓜爾膠和乙 基纖維素混合衣層不是連續(xù)的衣膜。分別在掃描電鏡下觀察瓜爾膠包衣小丸、 瓜爾膠-乙基纖維素混合包衣小丸和乙基纖維素包衣小丸的表面形態(tài)，結果如 圖3.12所示。由于引入了乙基纖維素，混合衣層的連續(xù)性要優(yōu)于瓜爾膠衣層, 但明顯不如乙基纖維素衣膜。

2_3.3包衣小丸釋藥機制

圖3.13展示了釋放度試驗進行至第4h時瓜爾膠-乙基纖維素混合包衣小 丸的形態(tài)，可以看出乙基纖維素形成難溶性的骨架，瓜爾肢形成親水通道， 藥物通過此通道釋出。瓜爾膠在衣層中的比例決定著親水通道的多少，包衣 層的厚度決定著釋放介質到達栽藥丸芯所要克服的路徑，這兩者共同決定了 最終的釋藥時滯時間3另外瓜爾膠在衣層中所占的比例也決定著時滯后藥物 的釋藥行為。瓜爾膠比例越高，衣層的酶敏感性越強，進入結腸后經酶促發(fā) 的藥物釋放更迅速。

由于混合包衣材料中的瓜爾膠除了具備高度的親水性外，還可以被結腸 內微菌群產生的酶特異性降解，因此存在于釋放環(huán)境中的酶可以成為促使藥 物開始釋放的誘因。但是這一誘因能否成功促發(fā)藥物釋放還依賴于釋藥系統 對水的通透性。系統對水的通透性高，酶才可以逐漸深入釋藥系統水解瓜爾 膠，釋出藥物。這與文獻報道的生物可降解型OCDDS所采用材料的親水性 的好壞決定著菌群能否有效地對其進行消化，引起/加快藥物釋放的結論一致 [4_7]。本研究的初衷是控制釋藥時滯大于5h,進入結腸后經菌群促發(fā)而釋藥， 這樣可以避免胃腸道轉運時間變異引起的結腸定位釋藥不準確。但研究結果 (圖3.10)表明酶進入釋藥系統水解瓜爾膠引發(fā)藥物釋放的時間與自身的釋 藥時滯一致。這表明包衣層中的瓜爾膠被水潤濕形成親水通道延伸至栽藥丸 芯時藥物開始釋出，瓜爾肢水解酶隨著親水通道的形成進入給藥系統，伴隨 藥物釋出的開始發(fā)揮酶解作用，在釋藥時滯后加速了藥物的釋放。

3.瓜爾肢-乙基纖維素混合包衣的5-FU小丸犬體內藥物動力學評價

犬口服5-FU載藥小丸、瓜爾膠-乙基纖維素混合包衣小丸的血藥濃度數 據分別見表3.8和表3.9,平均血藥濃度-時間曲線圖見圖3.14,藥動學參數見 表 3.10。

Tab3.8 plasma concentration (ng/ml) of 5-fluorouracil in dog after oral administration of uncoated pellets (n=5)

TimeNo. of subjectsX 土 SD

(h)12345

0000000

0.0833044.40028.2129.5220.43士 19.70

0.25138.22160.6229.64152.23122.43160.63土 41.21

0.5319.50366.6317.93318.96336.99331 別土 20.64

0.7590.2385.8255.6885.02130.1889.39土 26.61

128.7323.85021.3666.7728.13 土24.21

1.5000025.615.55 士 11.21

2000000

2.5000000

3000000

4000000

5000000

7000000

9000000

Tab3.9 Plasma concentration (ng/ml) of 5-fluorouracil in dog after oral administration of GG-ECcoated pellets (n=5)

TimeNo. of subjects

(h)12345

000000

100000

200000

300000

400000

5030.43000

633.220063.720

70084.36051.36

800000

1000000

1200000

2400000

Tab3.10 Mean (±S.D.) pharmacokinetic parameters of 5-fluorouracil in beagle dogs (n=5) after oraladministration of (dose 50 mg) of 5-FU formulations.

parametersUncoated pelletsGG-EC mixed coated pellets

Cmax (ng/ml)332.00±20.8952.62土 20.01 *

Tmax (h)0.50±0.006.20±0.75 *

vs uncoated pellets, at P<0.01

從結果可以看出2種小九體內行為有著顯著的差異。與載藥丸芯相比， 瓜爾膠-乙基纖維素混合包衣小丸的丁^為6.2h明顯長于載藥丸芯（0.5h)， (：_為52.62ng/ml遠低于載藥丸芯（332.00ng/ml),表明瓜爾膠-乙基纖維素 包衣小丸可在體內延遲藥物釋放。

與本文第一章中的Eudragit FS30D包衣小丸和Eudragit FS30D/瓜爾股雙 層包衣小丸一樣，瓜爾膠-乙基纖維素包衣小丸在犬體內只測得一個時間點的 血藥濃度，因此在圖3.14中僅對載藥丸芯做藥-時曲線圖，而對瓜爾膠-乙基 纖維素包衣小丸則以不同時間下實際檢出的平均血藥濃度柱狀圖表示藥物進 入體循環(huán)的時間及濃度。從圖3.14可以看出：與速釋栽藥丸芯相比，瓜爾膠 -乙基纖維素包衣小丸可顯著延緩藥物釋放，口服包衣小丸5-7h后，藥物進 入體循環(huán)，與體外5h左右的釋藥時滯接近，說明混合衣層可以保護藥物安全 通過胃及小腸，到達結腸后才開始釋放藥物，因此瓜爾膠-乙基纖維素包衣小 丸顯示出較好的結腸靶向性。 

111/211〕s-q Jo 120^5S3!IS

-HI?—uncoated pellets O GG-EC coated

 

Fig.3.14 Mean plasma concentration-time profiles of 5-fluorouracil (dose 50 mg) following oral administration of uncoated pellets and GG-EC mixed coated pellets(GG: EC=1:2, CWG405%) in beagle dogs (n=5).Bars represent standard deviation,

4.小結

本章采取時間控制-酶促發(fā)雙重策略，將瓜爾肢和乙基纖維素混合后對載 藥丸芯進行包衣，通過調節(jié)二者的比例及包衣增重即可實現延遲藥物釋放5h。 體內外試驗結果表明當瓜爾肢和乙基纖維素的比例為1:2,包衣增重為405% 時，藥物在5h左右的時滯后開始釋放，并在酶促作用下更快地將5-FU釋出， 藥物濃集于結腸局部，顯示出較好的結腸靶向性。

瓜爾膠和乙基纖維素混合后在流化床內對小丸包衣，操作簡便，釋藥時 滯可靠。兩種性質的高分子材料配比使用，利用混合材料的親水性/疏水性實 現目標釋藥時滯，改變了傳統時間控制型給藥系統采用的凝狡膨張/滲透泵/ 腸溶包衣等多種原理相結合的較為復雜的制備工藝[841]。這種新的延遲釋藥技 術不僅為OCDDS提供了簡便可行的制備方法，同時也為脈沖給藥系統提供 了有效可行的新方法。